【团体标准】 巴氏杀菌乳中碱性磷酸酶活性的测定 发光法

团体标准 T/TDSTIA008—2019 巴氏杀菌乳中碱性磷酸酶活性的测定 发光法 Determination of alkaline phosphatase activity in pasteurized milk - Enzymatic photo-activated system method 发布：2019-11-26 实施：2019-12-01 发布机构：天津市奶业科技创新协会 前言 本标准按照GB/T 1.1-2009《标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写》给出的规则起草。 本标准由国家奶业科技创新联盟提出，适用于联盟内部实施优质乳工程的企业，其他单位可参考。 本标准起草单位：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所、农业农村部奶产品质量安全风险评估实验室（北京）、农业农村部奶及奶制品质量监督检验测试中心（北京）。 本标准主要起草人：郑楠、张养东、文芳、王加启、刘慧敏、叶巧燕、屈雪寅、孟璐。 请注意本标准的某些内容可能涉及专利。本标准的发布机构不承担识别这些专利的责任。 1 范围 本标准规定了采用发光法测定碱性磷酸酶活性的方法。 本标准适用于巴氏杀菌乳。 本标准检出限为20mU/L。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 碱性磷酸酶活性 (alkaline phosphatase activity) 特定条件下每分钟转化1μmol稳定芳香族底物所需的碱性磷酸酶的量，用mU/L表示。 4 原理 在碱性磷酸酶的存在下，稳定的芳香族底物在35℃±1℃下水解，生成化学发光产物，大分子增强组分将光信号放大。在规定的孵育时间后，停止水解，在用已知酶活性片剂校准过的发光检测仪上，测量化学发光产物的量，并将其转换成碱性磷酸酶活性。 5 试剂或材料 除非另有规定，仅适用分析纯试剂。 5.1 水：GB/T 6682，一级。 5.2 非化学发光二氧杂环丁烷酯底物（0.2mol/L）：3-（2-螺旋金刚烷）-4-甲氧基-4-（3'-磷酸苯基）-1,2-二氧杂环丁烷二钠盐，溶于含1%荧光素的DEAE缓冲液。有商品化试剂可用（如Charm AP液体）。宜将底物储存于0℃~7℃之间；底物若在4℃、琥珀色塑料小瓶中储存，有效期6个月；若在30℃、琥珀色塑料小瓶中储存，只能稳定24h。在测定中使用底物时，将其保持在0℃~7℃或置于冰上。 5.3 终止液：称取1.337g 2-氨基-2-甲基-1-丙醇（CAS：124-68-5），用水溶解并定容至100mL；称取0.02g 苯扎氯铵（CAS：63449-41-2），用水溶解并定容至100mL。上述两种溶液各取50mL，混匀，调节pH至10.7，作为终止二氧杂环丁烷酯底物的酶水解反应的终止液。使用前需将其恢复至室温（18℃~24℃）。有商品化试剂可用（如Charm AP液体2）。该溶液在4℃可稳定1年，在室温下有效期2个月。 5.4 乙酸镁溶液：称取35.4g 四水合乙酸镁（CAS：142-72-3），溶于25mL水中，可适当加热以助于溶解，待温度冷却至室温后，定容至100mL。0℃~4℃储存，有效期1年。 5.5 碱性磷酸酶校准片：由有已知碱性磷酸酶含量的干燥生乳制成的片剂，碱性磷酸酶活性为875mU±26mU（注：原文为uU，根据上下文推测为mU或IU，此处保留原意修正单位格式），使用前用不含碱性磷酸酶的液体乳复原。市售碱性磷酸酶校准片在4℃下保存，有效期2年。有商品化试剂可用（如Charm AP校准片）。 5.6 巴氏杀菌乳校准液：取3支50mL试管分别标记为A、B和C。在每个试管中用100μL水溶解一个校准片。分别向管A中加入20mL，管B中加入5mL，管C中加入2.5mL无磷酸酶活性的巴氏杀菌乳样品，使校准液A、B和C的酶活性分别为44mU/L、175mU/L和350mU/L。盖上盖子，剧烈振荡。冷藏条件下放置10min。使用前混匀。 5.7 阳性质控：使用碱性磷酸酶冻干粉制备阳性质控，用10mL不含磷酸酶活性的阴性试样复原，静置10min，制得含450mU/L碱性磷酸酶的阳性质控，使用前剧烈振荡。复原的阳性质控在0℃~7℃可保存48h，在-15℃以下可保存2个月。使用时于室温水浴中解冻，剧烈振荡使其均质。不宜反复冻融。 6 仪器设备 6.1 化学发光检测仪：540nm，配温度探针，通过内置软件将线性输出信号直接转换为酶活性（如Charm Luminometer型号NovaLum）或带化学发光检测功能的酶标仪。 6.2 天平：感量为1mg，0.1mg。 6.3 移液器：100μL，1mL，5mL。 6.4 孵育器：35℃±1℃，63℃±0.2℃。 6.5 水浴锅：63℃±0.2℃，95℃±2℃。 6.6 一次性带盖小管：由不发光塑料制成，2mL。 6.7 试管：50mL，带防漏盖。 6.8 96孔酶标板：白色、不透明。 7 样品 7.1 总则 样品至少准备50mL或50g，测试前将样品混匀。测试时，样品应冷藏或在冰上进行测试，环境温度应在18℃~24℃之间。由于唾液中含有碱性磷酸酶，测试过程中应避免唾液的污染。 7.2 试样制备 7.2.1 巴氏杀菌乳试样 巴氏杀菌乳试样冷藏（0℃~7℃），混匀。 7.2.2 阴性试样 取适量试样在95℃水浴（6.5）加热保持1min，然后快速冷却。对于一些乳制品，如羊乳，在95℃下保持1min可能发生沉淀和分离，在这种情况下，可降低温度并延长时间。阴性试样若储存在0℃~7℃，可保存48h；在<-15℃的温度下储存，可保存6个月。经冷冻的阴性试样，需于室温水浴中解冻。使用前将剧烈振荡样品使其均匀，不宜反复冻融。用阴性试样校准光度检测仪零点，在适当校准的通道中，平均值应小于5mU/L。 8 试验步骤 8.1 校准1（适用于带直接测定酶活性结果的内置软件的化学发光检测仪） 8.1.1 应对每类乳制品分别进行校准，建立各种待测类型产品的校准曲线。当换用新批次/批号的底物和终止液时，需重新进行校准。 8.1.2 设定发光检测仪，默认背景值为100，校准值为100。