【团体标准】 巴氏杀菌乳中碱性磷酸酶活性的测定 发光法

T/TDSTIA008—2019
巴氏杀菌乳中碱性磷酸酶活性的测定发光法
Determination of alkaline phosphatase activity in pasteurized-Enzymaticphoto-activated systemmethodmilk-
全国团体
2019-11-26发布
天津市奶业科技创新协会
2019-12-01实施
本标准按照GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》给出的规则起草。
本标准由国家奶业科技创新联盟提出，适用于联盟内部实施优质乳工程的企业，其他单位可参考。
本标准起草单位：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所、农业农村部奶产品质量安全风险评估实验室（北京）、农业农村部奶及奶制品质量监督检验测试中心（北京）。本标准主要起草人：郑楠，张养东，文芳，王加启，刘慧敏，叶巧燕，屈雪寅，孟璐请注意本标准的某些内容可能涉及专利。本标准的发布机构不承担识别这些专利的责任。全国团体标准
1范围
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巴氏杀菌乳中碱性磷酸酶活性的测定发光法本标准规定了采用发光法测定碱性磷酸酶活性的方法。本标准适用于巴氏杀菌乳。
本标准检出限为20mU/L
规范性引用文件
业科技
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件
碱性磷酸酶活性alkalinephosphataseactivity特定条件下每分钟转化1umol稳定芳香族底物所需的碱性磷酸酶的量，用mU/L表示4原理
在碱性磷酸酶的存在下，稳定的芳香族底物在35℃土1℃下水解，生成化学发光产物，大分子增强组分将光信号放大，在规定的孵育时间后，停止水解，在用已知酶活性片剂校准过的发光检测仪上，测量化学发光产物的量，并将其转换成碱性磷酸酶活性。5试剂或材料
除非另有规定，仅适用分析纯试剂。5.1水，GB/T6682，一级。
5.2非化学发光二氧杂环丁烷酯底物（0.2mol/L）：3-（2-螺旋金刚烷）-4-甲氧基-4-（3'-磷酸苯基）-1,2二氧杂环丁烷二钠盐，溶于含1%荧光素的DEAE缓冲液。有商品化试剂可用[如2
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CharmAP?液体。宜将底物储存于0℃~7℃之间：底物若在4℃、琥珀色塑料小瓶中储存，有效期6个月；若在30℃、琥珀色塑料小瓶中储存，只能稳定24h。在测定中使用底物时，将其保持在0℃一7℃或置于冰上。5.3终止液：称取1.337g2-氨基-2-甲基-1-丙醇（CAS：124-68-5），用水溶解并定容至100mL称取0.02g苯扎氯铵（CAS：63449-41-2），用水溶解并定容至100mL。上述两种溶液各取50mL，混匀，调节pH至10.7，作为终止二氧杂环丁烷酯底物的酶水解反应的终止液。使用前需将其恢复至室温（18℃℃24℃)。有商品化试剂可用[如CharmAP?液体2)。该溶液在4℃可稳定1年，在室温下有效期2个月。5.4乙酸镁溶液：称取35.4g四水合乙酸镁（CAS：142-72-3），溶于25mL水中，可适当加热以助于溶解，待温度冷却至室温后，定容至100mL。0℃～4℃储存，有效期1年。5.5碱性磷酸酶校准片：由有已知碱性磷酸酶含量的干燥生乳制成的片剂，碱性磷酸酶活性为875uU±26uU，使用前用不含碱性磷酸酶的液体乳复原。市售碱性磷酸酶校准片在4℃下保存，有效期2年。有商品化试剂可用[如CharmAP?校准片P。5.6巴氏杀菌乳校准液：取3支50mL试管分别标记为A、B，和Cl，在每个试管中用100uL水溶解一个校准片。分别向管A中加入20mL，管B中加入5mL，管C中加入2.5mL无磷酸酶活性的巴氏杀菌乳样品，使校准液A/、B和C，的酶活性分别为44mU/L、175mU/L和350mU/L盖上盖子，剧烈振荡。冷藏条件下放置10min。使用前混匀。5.6阳性质控：使用碱性磷酸酶冻干粉制备阳性质控，用10mL不含磷酸酶活性的阴性试样复原，静置10min，制得含450mU/L碱性磷酸酶的阳性质控，使用前剧烈振荡。复原的阳性质控在0℃～7℃可保存48h，在-15℃以下可保存2个月。使用时于室温水浴中解冻，剧烈振荡使其均质。不宜反复冻融。6仪器设备
6.1化学发光检测仪：540nm，配温度探针，通过内置软件将线性输出信号直接转换为酶活性（如CharmLuminometer?型号NovaLum+)）或带化学发光检测功能的酶标仪。商品化底物溶液CharmAP液体可从CharmSciencesInc.获得。此处列出试剂品牌仅为提供参考，并不涉及商业目的。如果使用其他品牌可以得出相同的结果，标准使用者可以使用等效产品。终止液用于终止底物AMPPD的酶解反应。商品化终止液可从CharmSciencesInc.获得。此处列出试剂品牌仅为提供参考，并不涉及商业目的。如果使用其他品牌可以得出相同的结果，标准使用者可以使用等效产品。
商品化试剂CharmAPR校准片可从CharmSciencesInc.获得。此处列出试剂品牌仪为提供参考并不涉及商业目的。如果使用其他品牌可以得出相同的结果，标准使用者可以使用等效产品。商品化化学发光光度计可从CharmSciencesInc.获得。此处列出品牌仅为提供参考，并不涉及商业目的。如果使用其他品牌可以得出相同的结果，标准使用者可以使用等效产品。3
6.2天平：感量为1mg，0.1mg。
移液器：100μL，1mL，5mL。
孵育器：35±1℃，63℃±0.2℃。6.5
水浴锅：63℃±0.2℃，95℃±2℃6.6
一次性带盖小管：由不发光塑料制成，2mL。试管：
50mL，
带防漏盖。
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技创新
96孔酶标板：白色、不透明
样品至少准备50mL或50g，测试前将样品混匀。测试时，样品应冷藏或在冰上进行测试，环境温度应在18℃～24℃之间。由于睡液中含有碱性磷酸酶，测试过程中应避免唾液的污染。
试样制备
巴氏杀菌乳试样
巴氏杀菌乳试样冷藏（0℃～7℃），混匀。7.2.2阴性试样
TDSTIA
取适量试样在95℃水浴（6.5）加热保持1min，然后快速冷却。对于一些乳制品，如羊乳，在95℃下保持1min可能发生沉淀和分离，在这种情况下，可降低温度并延长时间。阴性试样若储存在0℃~7℃，可保存48h；在<-15℃的温度下储存，可保存6个月。经冷冻的阴性试样，需于室温水浴中解冻。使用前将剧烈振荡样品使其均匀，不宜反复冻融。用阴性试样校准光度检测仪零点，在适当校准的通道中，平均值应小于5mU/L。8试验步骤
8.1校准1（适用于带直接测定酶活性结果的内置软件的化学发光检测仪）8.1.1应对每类乳制品分别进行校准，建立各种待测类型产品的校准曲线。当换用新批次/批号的底物和终止液时，需重新进行校准。8.1.2设定发光检测仪，默认背景值为100，校准值为100。4