【团体标准】 动物源性食品呋喃唑酮代谢物3-氨基-2-噁唑酮的测定 酶联免疫吸附法

T/CAIA 中国分析测试协会标准 T/CAIA/SH005-2015 动物源性食品中呋喃唑酮代谢物3-氨基-2-噁唑啉酮的测定 酶联免疫吸附法 Determination of furazolidone metabolite 3-amino-2-oxazolidinone residues in animal origin foods — Enzyme linked immunosorbent assay method 2015-12-30发布 2016-04-01实施 前言 本标准按照GB/T 1.1-2009《标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写》给出的规则起草。 本标准由中国分析测试协会标准化委员会提出并归口。 本标准起草单位：北京勤邦生物技术有限公司。 本标准主要起草人：罗晓琴、朱亮亮、杨昌松、万宇平、贾芳芳、冯静、崔海峰、刘玉梅。 动物源性食品中呋喃唑酮代谢物3-氨基-2-噁唑啉酮的测定 酶联免疫吸附法 1 范围 本标准规定了动物源性食品中呋喃唑酮代谢物3-氨基-2-噁唑啉酮（3-amino-2-oxazolidinone，AOZ）的酶联免疫吸附（ELISA）测定方法。本标准适用于鸡肉、鸡肝、猪肉、猪肝、鱼肉、虾肉等动物源性食品中呋喃唑酮代谢物3-氨基-2-噁唑啉酮的测定。其他食品可参照执行本标准的方法。检出限为0.10 μg/kg。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 原理和方法提要 本方法为间接竞争ELISA方法。2-硝基苯甲醛与试样中的3-氨基-2-噁唑啉酮反应生成3-(2-硝基苯叉氨基)-2-唑烷酮（2-NP-AOZ）。酶标板微孔中包被有2-NP-AOZ抗原，与试样中的2-NP-AOZ抗原特异性竞争抗2-NP-AOZ抗体，加入酶标二抗，通过显色液进行显色。试样中2-NP-AOZ的含量与相对吸光度值成反比。用酶标仪测定450 nm波长下吸光度，配合分析软件计算试样中呋喃唑酮代谢物的含量。 4 试剂和材料 以下所用试剂，除特殊注明外均为分析纯试剂，水符合GB/T 6682规定的一级水。 4.1 试剂 4.1.1 2-硝基苯甲醛（NO₂C₆H₄CHO）：纯度不小于98.00%。 4.1.2 甲醇（CH₃OH）。 4.1.3 乙酸乙酯（CH₃COOCH₃）。 4.1.4 正己烷（CH₃CH₂CH₂CH₂CH₂CH₃）。 4.1.5 三水合磷酸氢二钾（K₂HPO₄·3H₂O）。 4.1.6 盐酸（HCl）：ρ≈1.18 g/cm³。 4.1.7 氢氧化钠（NaOH）。 4.1.8 吐温-20（C₂₁H₄₄O₈）。 4.1.9 二水合磷酸二氢钠（NaH₂PO₄·2H₂O）。 4.1.10 十二水合磷酸氢二钠（Na₂HPO₄·12H₂O）。 4.1.11 过氧化脲（CO(NH₂)₂·H₂O₂）。 4.1.12 四甲基联苯胺盐酸盐（C₁₀H₁₆N₂·2HCl）。 4.1.13 硫酸（H₂SO₄）：ρ≈1.84 g/cm³。 4.2 溶液配制 4.2.1 衍生化试剂：称取15.10 mg 2-硝基苯甲醛，加10.00 mL甲醇溶解，混匀。 4.2.2 磷酸氢二钾溶液 0.50 mol/L：称取114.00 g三水合磷酸氢二钾，加水定容至1000 mL，混匀。 4.2.3 盐酸溶液 0.30 mol/L：量取12.45 mL ρ=1.18 g/cm³的盐酸，加水定容至500 mL，混匀。 4.2.4 氢氧化钠溶液 1.00 mol/L：称取4.00 g氢氧化钠，加水定容至100 mL，混匀。 4.2.5 磷酸盐缓冲液 0.20 mol/L：准确称取25.80 g十二水合磷酸氢二钠、4.36 g二水合磷酸二氢钠，量取5.00 mL吐温-20，加水定容至500 mL，pH值为7.2。于2℃~8℃避光能够保存1个月。 4.2.6 磷酸盐缓冲液 0.02 mol/L：用水将0.20 mol/L磷酸盐缓冲液（4.2.5）按9:1体积比进行稀释，用于酶标板洗涤。于2℃~8℃避光能够保存1个月。 4.2.7 磷酸盐缓冲液 0.10 mol/L：准确称取12.90 g十二水合磷酸氢二钠、2.18 g二水合磷酸二氢钠，加水定容至500 mL，pH值为7.6。于2℃~8℃避光能够保存1个月。 4.2.8 磷酸盐缓冲液 0.05 mol/L：用水将0.10 mol/L磷酸盐缓冲液（4.2.7）按1:1体积比进行稀释，用于鸡肉、猪肉、鱼肉和虾肉提取试样的溶解。于2℃~8℃避光能够保存1个月。 4.2.9 磷酸盐缓冲液 0.025 mol/L：用水将0.10 mol/L磷酸盐缓冲液（4.2.7）按3:1体积比进行稀释，用于鸡肝和猪肝提取试样的溶解。于2℃~8℃避光能够保存1个月。 4.2.10 显色液：准确称取1.00 g过氧化脲和3.00 g四甲基联苯胺盐酸盐，加水定容至1000 mL。 4.2.11 硫酸 2.0 mol/L：准确量取11.1 mL ρ=1.84 g/cm³的H₂SO₄，缓慢加入水中，冷却至室温后，加水定容至100 mL。 4.3 标准品 3-(2-硝基苯叉氨基)-2-唑烷酮（C₈H₈N₃O₄）：纯度不小于99.00%，CAS：19687-73-1。 4.4 标准溶液配制 4.4.1 3-(2-硝基苯叉氨基)-2-唑烷酮标准储备液 1.00 mg/mL：用水作为溶剂，配制成1.00 mg/mL的3-(2-硝基苯叉氨基)-2-唑烷酮（2-NP-AOZ）标准储备液，于-20℃避光条件下能够保存12个月。 4.4.2 3-(2-硝基苯叉氨基)-2-唑烷酮标准工作溶液：用0.05 mol/L磷酸盐缓冲液（4.2.8）将1.00 mg/mL的3-(2-硝基苯叉氨基)-2-唑烷酮（2-NP-AOZ）标准储备液（4.4.1）配制成浓度分别为0 ng/L、25 ng/L、75 ng/L、225 ng/L、675 ng/L、2025 ng/L的2-NP-AOZ标准工作溶液。于2℃~8℃避光能够保存12个月。 4.5 呋喃唑酮代谢物残留酶联免疫检测试剂盒构成（技术要求参见附录A.1） 4.5.1 酶标微孔板：96孔，包被有2-NP-AOZ抗原。 4.5.2 抗体：抗2-NP-AOZ特异性单克隆抗体。 4.5.3 酶标二抗：羊抗鼠免疫球蛋白与辣根过氧化物酶的结合物。 5 仪器和设备 5.1 酶标仪：内置450 nm和630 nm滤光片，检测吸光度。 5.2 氮气吹干装置。 5.3 均浆机：转速不小于10000 r/min。 5.4 振荡器。 5.5 涡旋仪。 5.6 离心机：转速不小于3000 r/min。 5.7 恒温培养箱。 5.8 天平：感量0.00001 g、0.01 g。 5.9 微量移液器：单道20 μL~200 μL、100 μL~1000 μL；多道250 μL~1000 μL。 6 样品制备与保存 取新鲜或解冻的鸡肉、鸡肝、猪肉、猪肝、鱼肉、虾肉样品，剪碎，于10000 r/min均浆1 min。 制备好的样品，应即刻进行提取和检测。 注：鱼、虾壳应去除。 7 试样提取