【国家标准(GB)】 食品卫生微生物学检验 大肠杆菌计数

ICS 07.100.30
中华人民共和国国家标准
GB/T4789.382008
食品卫生微生物学检验
大肠杆菌计数
Microbiological examination of food hygiene-Fnumeration of Escherichia coli2008-11-21发布
中华人民共和国卫生部
中国国家标准化管理委员会
2009-03-01实施
中华人民共利国
国家标准
食品卫生微生物学检验
大肠杆菌计数
GR/T 4789,38- 2008
中国标准出版社出版发行
北京复兴门外三里河北街16号
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电话：6852394668517548
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开本880×12301/16
印张 1字数 24千宁
2009年3月第一版
2009年3月第一次印刷
书号：155066·1-36115定价16.00元由本社发行中心调换
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GB/T 4789.38—2008
本标准的第一法和第二法修改采用美国食品药品管理局(FDA)细菌学分析乎册》第4章大肠析菌和大肠菌群计数(2002 年)(Bactcriological Analytical Manual,Chaptcr 4,Enumeration of Escherichia coti and the caliform bacleria,2002)，第三法修改来用国际分析家学会（AOAC INTERNATIONAL)AOAC991.14≤食品中大肠菌群和大肠杆菌计数Pctrifilm测试片法》（1994年）（AOAC.OricialMethod 9g1, 14,Coliform and Eseherichiu cti colinls in foods Dry rehydratahle film Petrifilm E, coficauntplateandPetrifilmcoliformcountplatemethods，1994)和A(AC998.08%禽、肉和水产品中大肠杆菌计数（1998年）（A0ACOfficialMethod998.08,ComfirmedEscherichiacotiinpoultry，meatsand scafood -Dry rehydratable film method Petrifilm E. coti count plate, l998) .本标准的第-法和第二法与FDA方法的主要区别是：将样品制备时取样量50g（或50ml）修为25名（或25mL）；将培养温度35℃1℃修改为36℃+1℃；将EC培养温度 45. 5 ℃±0. 2 ℃(一般食品)和 44. 5 ℃±0. 2 ℃(贝类)统一为 44. 5 ℃±o.2℃
本标准的第法与 AOAC方法的上要区别是：将样品制备时取样50g（或50mL）修改为25g（或25mL）；将培养温度35℃十1℃修改为36℃±1℃。本标准的附录 A.附录 B 为规范性附录。本标准电中华人民法和国卫生部提出并归。本标准由中华人民共和国卫生部负责解释。本标准负责起草单位：中国疾病预防控制中心营养与食品安全所。本标准参与起草单位：中华人民共和国内蒙古出人境检验检疫局、江苏省疾病预防控制中心、上海市疾病预防控制中心、中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局。本标准主要起草人：刘秀梅、刘中学、袁宝君、刘弘、陈敏卢行安、田静。1
1范围
食品卫生微生物学检验
大肠杆菌计数
木标雄规定了食晶中大肠杆菌计数的法。本标谁适用于各类食品中大肠杆菌的计数，其中第二法不适用于贝类产品。2术语和定义
下列术语和定义适用于本标准。2.1
GB/T 4789.38—2008
大肠杆茵Escherichia coli
广泛存在于人和温血动物的肠道中，能够在44.5℃发酵乳糖产酸气，IMViC（靛基质，甲基红，VP试验、柠檬酸盐)生化试验为十十二一或一十一一的革兰氏阴性析菌。以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生状况，推断食品中肠道致病菌污染的可能性。2.2
最可能数
most probable number; MPN
基于泊松分布的·-种间接计数方法3设备和材料
除微生物实验室常规火菌及培养设备外，其他设备和材料如下：3.1恒温培养箱：36℃±1℃。
3. 2 冰箱:2 ℃～5℃
3.3恒温水裕箱：44.5℃±0.2℃。3.4天平：感量0. 1 g。
3.5均质器。
3.6振荔器。
3.7无菌吸管：1mL(具0.01mL刻度）、10mL(具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头：3.8无菌锥形瓶：容量500ml。
3. 9无菌培养血;直径 90 mm
3.10pH计或pH比色管或精密pH试纸，3.11菌落计数器或PctrifilmTm1>自动判读仪。3.12紫外灯：波长360nm~366nm，功率≤6W。A培养基和试剂
4.1月桂基磺酸盐胰蛋白陈（laurylsul(atetryptose,LST)肉汤：见第A,1章。4.2EC肉汤(E.coibroth)：见第A.2章。4.3蛋白陈水:见第A.3章，
4.4缓冲葡荷糖蛋白陈水(MR-VP实验用）：见第A.1章。4.5Korser柠檬酸盐肉汤：见第A,5章。PetrifilnTu是由3M公司提供的产品的商品名。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产1）
品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效的产品。品成伴网ht
GB/T 4789.38—2008
磷酸盐缓冲腋：见第A.6章。
伊红美蓝(easin mcthylene bilue,EMB)琼脂：见第 A.7章。营养琼脂斜面:见第 A,8章。
4.9结晶紫中性红胆盐(violetredbilc，VRB)琼脂：见第A,9章。VRB-MUG琼脂：见第A.10章。
革兰氏染色液：见第A.11章。
Kovars 靛基质试剂:见第 A. 12 章。甲基红指示剂：见第A.13章。
Voges-pros kauer(V-P)试剂:见第 A. 14 。无菌生理盐水，称取8.5g氯化钠溶于1000mL蒸馏水中，121℃高压灭菌15min。tmol/L氢氧化钠(NaOH)：称取40g氢氧化钠溶于1000mL蒸馏水中。Imo1/L盐酸（HCl)：移取浓盐酸90ml用蒸馏水稀释至I000mL。PctrililmEM大肠菌群/大肠杆菌检验澍试片。第一法大肠杆菌MPN计数
5检验程序
见图1。
25g（或25 ml)样品1-225 mL稀液。均质10倍系列稀释
选择适宜3个连续稀释度的样品勾液，接种LST肉汤管36 ℃+1 ℃
不产气
48h±2h
EC肉汤
44. 5±0. 2℃
不产气
48b±2h
EMB平板划线
36 ℃±1 ℃
18h~24h
可蜓菌落移种营养琼胎斜面或平板36 ±1 ℃
18h-24h
IMViC生化试验，求兰氏染色
阴性管
查MPN表
报告结果
图1大肠杆菌MPN计数法检验程序2
http:
rungfooc
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阳性管
6操作步骤
6.1样品的稀释
GB/T 4789.38—2008
6.1.1固体和半固体样品：以菌操作取25g样品，置盛有225mL磷酸盐缓冲液的无菌均质杯内80001/min~10000r/min均质1min~2min，制成1：10样品勾液，或置盛有225mL磷酸盐缓冲液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min制成1：10的样品勾液。6.1.2液体样品：以无菌吸管吸取样品25mL置盛有225ml.磷酸盐缓冲液的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的玻璃珠)中，充分振摇，制成1：10的样品勾液。6.1.3样品匀液的PH值应在6.5~～7.5之间，必要时分别用1ol/L氢氧化钠6.1.4用1mL无菌吸管或微量移液器吸取110样品勾液1mL，沿管徐徐注入盛有9mL磷酸盐缓冲液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支1ⅡL无菌吸管或吸头反复吹打，使其混合均匀，制成1：100的样品匀液。6.1.5根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成10倍递增系列样战勾液。每递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸管或吸头。从制备样品勾被至样品接种完毕，全过程不得超过15min，6.2初发酵试验
每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品勾液（液体样品可以选择原液）。每个稀释度接种3管月桂基磺酸盘胰蛋白陈(LST)肉汤，每管接种1mL（如接种量超过1ml则用双料LST肉汤）。36℃士1℃培养24h士2h观察小倒管内是否有气泡产生，如未产气则继续培养垒48h土2h，记录在24h～48h内产气的LST肉汤管数。如所有LST肉汤管均末产气，即可报告大肠杆菌MPN结果，如有产气者，则进行复发酵试验。6,3复发酵试验
用接种环分别从所有培养18h土2h内发酵产气的1.ST肉汤管中取培养物1环，移种十已提前预温至45℃的EC肉汤管中，放人带盖的14.5℃三0.2℃水浴箱内。水裕的水面应高于肉汤培养基液面，培养24h士2h，检查小倒管内是否有气泡产生，如末产气则继续培养至48h土21。记录在24h利48h内产气的EC肉汤管数。如所有EC肉汤臂均未产气，即可报告大肠杆菌MPN结果，如有产气者则进行EMB平板分离培养。
6.4伊红美蓝平板分离培养
轻轻振摇各产气管，用接种环取培养物划线分别接种于EMB平板，36℃±1℃培养18h～24h检验平板上有无具黑色中心有光泽或尤光泽的典型菌落。6.5营养琼脂斜面或平板培养
从每个平板[-挑5个典型菌落，如无典型菌落则挑取可疑菌落。用接种针接触菌落中心部位，移种到营养琼脂斜面或平板13GC土1℃，培养18h～24h。取培养物进行革兰氏染色和生化试验。6.6生化试验
6.6.1靛基质试验：将培养物接种蛋白陈水，36℃土1C培养24h土2h后，加Kovacs靛基质试剂0.2ml0.3mL，上层出现红色为靓基质阳性反应，6.6.2MR-VP试验：将培养物接种MR-VP培养基，36℃土1C培养48h士2h。移取培养物1mL.至13mm×100mm试管中，加5%α-素酚乙醇溶液0.6mL、40%氢氧化钾溶液0.2ml.和少许肌酸结晶，振摇试管后静置2h，如出现红色，为VP试验阳性。将MRVP培养液的剩余部分再培养48h后滴加5滴甲基红指示剂。培养物变红色，为甲基红试验阳性，若变黄色则为阴性反应。6.6.3柠檬酸盐利用试验：将培养物接种Koscr氏柠檬酸盐肉汤，36℃+1℃培养96h士2h，记录有无细菌生长。
GB/T 4789.38—2008
大肠杆菌与非人肠杆菌的生化鉴别见表1.表1大肠杆菌与非大肠杆菌的生化鉴别靛基质(I)
甲基红（MR）
VP 试验(VP)
柠檬酸盐（C）
墨延(型别）
典型大托菌
非典型大肠杆菌
典型中间型
非典型中间型
典型产气肠杆菌
非典型产气肠杆
注1：如出现表1以外的生化反应类型，表明培养物可能不纯，应重新刘线分离，必要时做重复试验。注2：生化试验也可以选用VITEKGNI鉴延卡、API20E等方法，按照产品说明书进行操作。6.7大肠杆菌MPN计数的报告
大肠杆菌为革兰氏阴性无芽胞杆菌，发酵乳糖、产酸、产气，IMViC生化试验为+：+一一或。只要有1个菌落鉴定为大肠杆菌，其所代表的LST肉汤管即为大肠杆菌阳性。依据LST肉汤阳性管数查MPV表（见附录B)，报告每克(或亳升）样品中大肠杆菌MPN值。大肠杆菌VRB-MUG乎板计数法
第二法
检验程序
见图2。
25g（或25mL）样品+225mL稀释液，均质10倍系列稀释
选择2个3个适宜连续稀释度的样品液，按种VRB-MUJG半板36 ℃±1 ℃
18 h~21 h
紫外灯照射，计数发荧光菌落
报告结果
图2大肠杆菌VRB-MUG平板计数法检验程序8样品稀释
按6.1进行。
9检验
GB/T 4789.38—2008
选取2个-3个适宜的连续稀释度的样品句液，每个稀释度分别取1mL注人两个无菌平。另取1 mL稀释液注人一个尤菌平血中,作空白对照：将 45 ℃土0. 5 ℃的 VRB琼脂 10 mL~15 mL 倾注于每个平Ⅲ中。小心旋转平Ⅲ,将培养基与样品匀液充分混勾。待琼脂凝固后,再加 3 nL～4InL VRBMUG琼脂盖平板表层。疑固后翻转平板，36℃土1℃培养18h～24h。选择菌落数为10~100的平板，暗窄中360nm～366nm波长紫外灯照射下，计数平板上发浅蓝色荧光的菌落，检验时用已知MUG阳性菌株（如大肠杆菌ATCC25922)和产气肠杆菌（如ATCC13048)做阳性和阴性对照。
10大肠杆菌平板计数的报告
两个半板上发荧光菌落数的平均数乘以稀释倍数，报告每克（或毫升）样品中大肠杆菌数，以CFU/g(CFU/mlL)表示.
第三法大肠杆菌PelrifilimrM测试片计数法11检验程序
见图3。
25g（或25ml.）样品+225mL稀释液，均质10倍系列稀释
选择适宜2个~~3个连续稀释度的样品勾液，接种Pctrifilm:M测试36 ℃±1 ℃
24h±2 h或48 h±2 h
计数Petrifilm\hi测试片上的蓝色借气泡菌报告结果
图3大肠杆菌PetrifilmM测试片计数法检验程序12样品稀释
按6.1进行。
13检验
13.1接种和培养
选取2个～3个适宜的连续稀释度的样品匀液，每个稀释度接种两张测试片。将测试片置于平坦实验台面，揭开上层膜，用吸管吸取样品匀液1mL垂直滴加在测试片的中央，将上层膜缓慢益下，避免5
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GB/T 4789.38—2008
气泡产生和.1-层膜直接落下，将压板（平面底朗下）放置在上层膜中央处，轻轻地乐下，使样品匀液均勾覆盖于圆形的培养膜表面，切勿扭转压板。拿起压板，静置至少1min以使培养基凝固。将测试片的透明面朝上置于培养箱内，堆叠片数不超过20片，36℃士1℃培养。肉、家禽和水产品，培养时间为24h士2h;其他食品，培养时间为48 h士2h，13.2判读
肉服观察计数，或用菌落计数器、放大镜.PetririlrnrM自动判读仪计数。蓝色有气泡的菌葬确认为人肠杆菌，不论蓝色的深浅，部分蓝色的带气泡菌落也判定为大肠杆菌。圆形培养膜边缘及边缘以外的菌落不计数。当测试片出现大量气泡、不明显的小菌落，培养区呈蓝色时，需要进一步稀释样品勾液，重新检验。
14大肠杆菌测试片计数的报告
选择菌落数在15～150之间的稀释度，两张测试片菌落平均数乘以稀释倍数，即为每克(或毫升)样品巾大肠杆菌数，以CFU/g(CFU/mL)表示。如果所有稀释度测试片七的菌落数郁小于15，计数最低稀释度测试片上的平均菌落数乘以稀释倍数报；如果所有稀释度的测试片上均无菌落生长，以“小于1乘以最低稀释倍数”报告；如果所有稀释度的菌落数都人于150,计数最高稀释度测试片上的平均菌落数乘以稀释倍数报告。计数菌落数大于150个的测试片时，可计数·个或两个具有代表性的方格内的菌落数，换算成单个方格内的菌落数后乘以20，即为测试片1估算的菌落数（圆形生长面积为20cm）。6
A.1月桂基磺酸盐胰蛋白陈(LST)肉汤A.1.1成分
胰蛋白陈或胰酪陈
氯化钠
磷酸氢二钾（K,HPO,）
磷酸二氨钾(KH,PO)
月桂基硫酸钠
蒸馏水
pH6.8±0.2
A. 1.2制法
附录A
（规范性附录）
培养基和试剂
1 000 nL
GB/T4789.38—2008
将上述成分溶解于蒸馅水中，调节pII。分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10mL，121C高压灭菌 15 min。
制备双料LST肉汤时，除蒸馏水外其他成分加倍。A,2EC肉汤
A.2.1戒分
胰蛋白豚或胰酪陈
3号胆盐或混合脏盐
磷酸氢二钾(K.HPO,)
磷酸二氢钾（KH,PO)
氯化钠
蒸馏水
pH6. 9±0.1
A.2.2制法
1 000.0 mL
将上述成分溶解于蒸馏水中，调节pH，分装于有倒立小发酵管的试管中，每管8mL。121℃高压灭菌 15 min。
A.3蛋白陈水
A,3.1 成分
膀陈或胰酪陈
蒸馏水
pH6. 9±0. 2
A.3.2制法
1 000. 0 ml
加热搅拌解映豚或胰酪陈于蒸馏水中。分装试管，每管5mL。121℃高压灭菌15tmin。7
http:/
ate net
GB/T 4789.38200B
A, 4缓冲葡萄糖蛋白陈水(MR-VP 实验用)A.4.1成分
葡萄糖
癣酸氨二钾(K,HPO,）
蒸馏水
pH6.9±0.2
A.4.2制法
1 000.0 mL
将上述成分溶于蒸馅水中，调节pH,分装试管，121℃高压灭菌15min。A.5Korsr氏柠檬酸盐肉汤
A.5.1成分
磷酸氢铵钠(NaNHHPO4·4H,O)
磷酸氨一钾（KHPO
硫酸镁(MgS0,·7H,0)
柠檬酸钠（含2H,O）
蒸馏水
pH6.7±0.2
A.5.2制法
1 000. 0 mL
将上述成分溶解于蒸馏水中，调节pH,分装试管，每管10mL,121℃高压炎菌15min。A.6磷酸盐缓冲液
A.6.1成分
磷酸二氨钾（KH,PO,）
蒸馏水
A, 6.2制法
500 mL
贮存液：称取34.0g的磷酸二氢钾溶于500mL蒸馏水中，用大约175mL的1mol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.2.用蒸馏水稀释至1000mL后贮存于冰箱。稀释液：取贮存液1.25mL，用蒸馏水稀释至1000ml，分装于适宜容器中，121℃高压灭菌15min。
伊红美蓝琼脂（EMB)
A.7.1成分
蛋白豚
磷酸氢二钾（K,HPO）
伊红水溶液）
蒸馏水
pH 7. 1±0.2
0. 1 多或 2%水溶液 20 mL
0.065g或0.5%水溶液13ml.
1 000.0 mL
品成伴网httn
A.7.2制法
GB/T 4789.38—2008
在1 000 mL 蒸馏水中煮沸溶解蛋白陈,磷酸盐和琼脂,加水补足。分装于三角烧瓶中，钙瓶100 mL 或 200 mL,调节 pH,高压灭菌。使用前将琼脂融化,于每 1U0 mL.琼脂中加5 ml. 灭菌的 20%乳糖溶液,2 mL的 2%的伊红 水溶液和 1. 3 mL 0. 5%的美蓝水溶液,摇勺,冷至 45 ℃～50 ℃倾注平血。
A.8营养琼脂斜面
A.8.1成分
牛肉膏
蛋白陈
蒸馏水
pH7.3±0.1
A.,B.2制法
1 000. 0 mL
将上述成分加于蒸馏水中，点沸溶解，调节pH，分装合适的试管，121℃高压灭菌15min。灭菌后摆成斜面备用。
A, 9结晶紫中性红胆盐(VRB)琼脂A. 9. 1 成分
蛋白膝
酵母膏
氯化钠
胆盐或3号服盐
中性红
结晶紫
蒸馏水
pH7.4±0. 1
A.9.2制法
15 g～18 g
1 000.0 mL
将上述成分溶于蒸水中，静置儿分钟，充分揽拌，调节pH。煮沸2min，将培养基冷至45℃～50℃癫注平板，临用时制备，不得超过3h。A.10VRB-MUG琼脂
A.10.1成分
蛋白陈
酵母湾
氯化钠
胆盐或 3号胆盐
中性红
结晶紫
15 g-18 g
http:
rungfooc
atenet
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