【国家标准(GB)】 食品卫生微生物学检验 食品中乳酸菌检验

ICS 07. 100. 30
中华人民共和国国家标准
GB/T 4789,352008
代替 GB/T 4789.35—2003
食品卫生微生物学检验
食品中乳酸菌检验
Microbiological cxamination of food hygieneExamination of lactic acid bacteria in foods2008-12-03发布
中华人民共和国卫生部
中国国家标准化管理委员会
2009-03-01实施
CB/T 4789.35—2008
本标准代替GB/T4789.35-2003≤食品卫牛微牛物学检验乳酸菌饮料中乳酸菌检验”。本标准与GB/T4789.352003相比主要修改如下；将乳酸菌饮料中乳酸菌检验》改为《食品中乳酸菌检验》；-将选择性分离培养基出改良TJA培养基（改良番茄汁琼脂培养基）改为MRS培养基；修改了原标准中生化试验部分；乳酸菌计数由倾注法修改为涂布法；乳酸菌的鉴定由必做项目修改为选作项目。本标准的附录A是规范性附录。
本标推由中华人民共和国卫生部提出并归口。本标准由中华人民共和国卫生部负责解释。本标准负责起草单位：中国疾病预防控制中心营养与食品安全所。本标准主要起草人：徐进、刘秀梅、杨宝兰、李志刚。本标准所代替标推的历欲版本发布情况为：GB 4789. 35
1996.GB/T 4789.35-.-2003.
合品成伴网httn：
1范围
食品卫生徽生物学检验
食品中乳酸菌检验
本标准规定了含乳酸菌食品中乳酸菌（lacticacid bactcria)的检验方法。本标适用于含活性乳酸菌的间体，半固体和液体食品中乳酸菌的检验。2规范性引用文件
GB/T 4789.35--2008
下列文件中的条款通过本标难的引用面为本标推的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容或修订版均不适用于本标推，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本，凡是不注口期的引用文件，其最新版本适用于本标推。GB/T4789.34食品卫牛微牛物学检验双歧杆菌检验3术语和定义
下列术语和定义适用于本标准。3.1
乳酸菌 lactic acid bacteria
类可发酵糖主要产生大量乳酸的细菌的通称。与食品工业密切相关的乳酸菌主婴为乳杆菌屑(Lartobacilius）双歧杆菌属（Bifidobacrerium）和链球菌属（Streptucocrus）中的热链球菌（Streptococcus thermophitus)等.
4设备和材料
除微生物实验室常规火菌及培养设备外，其他设备和材料如下。4.1恒温培养箱:36℃±1℃。
4. 2 冰箱;2 ℃~5 ℃。
4.3均质器及无菌均质袋、均质杯或灭菌乳钵。4.4天平：感量0.1g。
4.5 无菌试管:18 mmX180 mm,15 mmX100 mm。4.6无菌吸管：1mL具0.01mL刻度）、10mL(具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头。4.7无菌钮形瓶：500mL、250mL。5培养基和试剂
5.1API50CH生化鉴定试剂盒\。5.2MRS(man rogosa sharpe)培养基:见第 A.1竞。5.3MC(modilied chalmers )培养基:见第 A.2章。5. 4 0. 5%账糖发醇管:见第 A, 3 章。5.50.5%纤维二糖发酵管：见第A.3章。1）由法国生物梅里埃公司提供的产品的商品名。给出这-信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效的产品。1
GB/T 4789.35--2008
5.60.5%麦芽糖发酵管：见第A.3章。5.70.5%甘露醇发酵管：见第A.3章。5. 8 0. 5%水杨苷发酵管:见第 A. 3 章。5.90.5%山梨醇发酵管：见第A.3章。5.100.5%乳糖发酵管：见第A.3章。5,11 七叶背发酵管:见第 A,4章。革兰氏染色液：见第A.5章。
6捡验程序
乳酸菌检验程序见图1。
样喆25g（25mI)-f225ml.灭菌牛理益水10倍系列稀释
选择2个~.3个适当稀释度,各以0. 1 ml.加入到MRS 琼脂平板和(或)MC琼脂Y板进行涂布样品含双歧杆菌
琰氧，
35 ℃-1℃,
7操作步骤
7.1样品制备
菌落计数
样品不含双歧杆菌
兼性战氧，
36 ℃上1C,
挑取菌落接种于MRS琼脂平板
或MC琼脂平板（可选择）
菌种鉴定
乳酸菌检验程序图
7.1.1样品的全部制备过程均应遵循无菌操作程序7.1.2冷冻样品可先使其在2℃～5℃条件下解冻炼，时间不超过18h，也可在温度不超过45℃的条件2
http:
rungfood
atenet
下解冻,时间不超过 15 min。
GB/T 4789.35--2008
7.1.3固体和半固体食品：以无菌操作称取25g样品，置于装有225L生现盐水的无菌均质杯内，丁8000r/min~10000r/min均质1min~~2min，制成1：10样品匀液；或置于装有225mL生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1tnin～2min制成1：10的样品句液。7.1.4液体样品：液体样品应先将其充分播匀后以无菌吸管吸取样品25mL放人装有225ml生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分振摇，制成1：10的样品勾液。7.2步骤
7.2.1用1mL无菌吸管或微量移液器吸取110样品匀液1mL，沿管壁缓慢注丁装有9ml.生理盐水的无菌试管中（注意吸管尖端不要触及稀释羧),振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制战1：100的样品匀液。
7.2.2 另取 1 ml.无菌吸管或微量移液器吸头,按上述操作颇序,做 10 倍递增样品匀液,每递增释一，即换用1次1 mL灭菌吸管或吸头。7.2.3根据待检样品活菌数的估计，选择2个-~3个连续的适宜翻释度，每个释度吸取0.1mL稀释液分别置于2个 MRS琼脂平板或MC琼脂平板，使用 L形棒进行表面涂布。根据样品中所含乳酸菌的种类选择培养基皮培养条件，见表1，每：-种培养条件的每个稀释度作两个平而。乳酸菌在MRS和MC培养基F菌落牛长形态特征见表2.从样品稀释到平板涂布整个试验过程要求在20min内完成。表1乳酸菌计数培养基及培养条件的选择样品中所含菌属
只含乳杆菌属
只含双歧杆菌属
同时含乳杆菌属和双歧杆菌离
只嗜热链球菌
同时含乳杆菌属、双歧打菌属
嗜热链球菌
MRS琼脂平-板,36 ℃11℃,48 h
兼性厌氧
注：}表示使用此培养基及培养条件；一表示不使川此培养基及培养条件。MC琼脂平板,36 ℃+1 ℃,48 h
兼性厌氧
表 2 乳酸菌在不同培养基上菌落特征荫
乳杆幽属
(Lactobacillus)
双歧杆菌属
(Bifidohacterium)
嗒热链球菌
(Streptacoccus
thernphius)
8报告
MRS琼脂
菌落圆形，中等大小，凸越，微白色，湿MC 琼脂
菌落较小，白色或淡粉色,边缘不太整齐，润,边缘齐,直径为3 mm+1 mm,菌落背面可有淡淡的竿,直径2 mm士1 mnl,菌落背面为黄色
兼性厌氧培养条件下不生长。在厌氧培养为粉红色
兼性厌氧培养条件下不生长，在厌氧培养条件下，菌落是圆形，荫猎中等大小，瓷白色，条件下，菌落较小，可有淡说的晕，白包，边边缘整齐光滑,直径为 2 mm±1 mm,菌荐背齐,直径 1. 5 mm± 1 mm，菌落背面为粉面为黄色
菌落是圆，菌落偏小，白色，湿润，边缘齐，直径为 1 mm土Imm,菌落背面为黄色红色
肖落中等偏小·边缘整齐光滑的红色菌落，可有淡淡的晕,直径2 mml1 m,菌落背面为粉红色
根据菌落计数结果山具检测报告。将最终确定的乳酸菌菌落数在30～300之间的平板进行计数，3
全品伙伴网ht
GB/T 4789.35-2008
再乘以相应的稀释倍数，采用10的指数表示，每克（或暑升）食品中所含有的乳酸菌数以“CFU/g（或CFU/mL)”表示。具体方法按菌落总数的规定报告。9乳酸菌的鉴定可选择）
9.1纯培养
挑取3个或以上单个菌落，嗜热链球菌接种于MC琼脂平板，乳杆菌接种于MRS琼脂平板，置36 ℃+1 ℃兼性厌氧培养 48 h。9.2鉴定
9.2.1双歧杆菌的鉴定按GB/T4789.34操作。9.2.2涂片镜检：乳杆菌属菌体形态多样，呈长杆状，弯曲杆状或短杆状，无芽跑，革兰氏染色阳性。嗜热链球菌菌体呈球形或球杆状，直径为0.5μm~2.0um，成对或成链排列，无芽胞，革兰氏染色阳性。9.2.3API 50CH 生化鉴定试剂盒鉴定:选择纯培养平板上的 3 个独立菌落,分别使用 AP1 50CH 生化鉴定试剂盒进行牛化反应检测，乳酸菌菌种主要生化反应见表3和表4。表3常见乳杆菌属内种的生化反应种
干酪乳杆菌干酪亚种(L. casei
subsp.casei)
德医乳杆菌保加利亚亚种（L.del-bruerkii suhsp. hutgaricus)
嗜酸乳杆菌（L.cidophius)
罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)
鼠李糖乳杆幽(L,rhamnosus)
植物乳杆留（L.planarurn）
七叶省
纤维一糖
麦芽糖
廿露醇
注：十表示90%以上菌株阳性；一表示90%以上菌株明性：N1)表示未测定。表 4嗜热链球菌的主要生化反应蘭种
嗒热链球菌（S.therophilus)
廿露醇
注：+表示90%以上菌株阳性；--表示90%以上菌株阴性。品成纯网
水杨苷
水杨苷
山梨醇
山梁醇
马尿酸
A.1MRS 培养基
A.1.1成分
蛋白陈
牛肉粉
醇母粉
葡葡糖
吐温80
磷酸氢—钾(K,HPO4·7H,0)
z酸钠(CH,COONa·3H,O)
柠檬酸三铵
硫酸镁(MgS7H,O)
硫酸锰(MnSO,·4H20)
琼脂粉
蒸馏水
A. 1.2制法
附录A
(规范性附录）
培养基及试剂
1 000 m1.
GB/T 4789.35—2008
将上述成分加人蒸馏水中，加热溶解，校正pH6.2,分装后121℃高压灭菌15min～20 min，A.2MC 培养基
A,2. 1 成分
大豆蛋白陈
牛肉粉
酵舟粉
葡萄糖
碳酸钙
蒸馏水
1%中性红溶液
A.2.2制法
1000mL
将前面7种成分加入蒸馏水中,加热溶解，校正PI16.0,加人中性红溶液。分装后121℃商压灭菌15 min~20min。
A.3乳酸杆菌糖发酵管
A.3.1成分
牛肉膏
http:
rungfooc
atonot
GB/T 4789.35—2008
蛋白陈
醇舟浸膏
吐温80
1.6%溴甲酚紫酒精溶液
蒸馏水
A.3.2制法
1 000 ml.
按0.5%加人所需糖类，并分装小试管。A.4七叶苷发酵管
A.4.1成分
蛋白陈
磷酸氢二钾
拘酸铁
1.6%溴甲酚紫酒精溶液
蒸馏水
A.4.2制法
100 mL
将上述各种成分溶人100 mL蒸馏水中,121℃高压灭菌15min~20minuA.5革兰氏染色液
A.5.1结晶紫染色液
A.5.1. 1成分
结品紫
95%乙醇
1%草酸铵水溶液
A. 5. 1. 2制法
将结晶紫完全溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。A.5.2革兰氏碘液
A.5.2.1成分
碘化钾
蒸馏水
A. 5.2.2制法
将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300InL。A,5.3沙黄复染液
A.5.3.1成分
95%乙醇
蒸馏水
A.5.3.2制法
将沙黄溶解丁乙醇中，然后用蒸馅水稀释。6
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A.5.4染色法
将涂片在酒精灯火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染1min，水洗；a)
滴加革兰氏碘液，作用1min,，水洗；b)
GB/T 4789.35—2008
滴加95%乙醇脱色，约15g~30s，直全染色液被洗掉，不要过分脱色，水洗；滴加复染液，复染1 min。水洗、待干、镜检。http://foodmate.netGB/T 4789.35-2008
中华人民共秆国
国家标推
食品卫生微生物学检验
食品中乳酸菌检验bZxz.net
GB/T 4789. 35—2008
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印张0.75字数14千字
2009年3月第一版
2009年3月第一次印刚
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