【国家标准(GB)】 食品卫生微生物学检验 金黄色葡萄球菌计数

ICS 07. 100. 30
中华人民共和国国家标准
GB/T 4789.372008
食品卫生微生物学检验
金黄色葡萄球菌计数
Microbiological exanination of food hygieneEnumeration of Staph ylococcus aureus2008-11-21发布
中华人民共和国卫生部
中国国家标准化管理委员会
2009-03-01实施
GB/T 4789.37—2008
本标推的第一法修改采用国际分析家学会（AOACINTERNATIONAL)AOAC975.55《食品中金黄色葡葡球菌表面平板分离和计数法》（AOACOfficizlMethud975.55，Staphytococcusuureusinfoodssurface plating method isolation and etumberation,1976),国际标准化组织(ISO)ISO 6888-1:1999《食品和动物饲料中而浆凝固酶阳性葡萄球菌计数方法》（Microbiologyof foodandanimalfecdingstuffsHorizonlal mcthod for the cnumcration of coagulase-positive staphylococci, Siaphylococrus aureausand ather species,1999);第二法修改采用国际分析家学会(AOACINTERNATIONAL)AOAC987.09《食品中金黄色葡药球菌分离和计数法MPN法》（1991年）（AOACOfficialMcthod987.09，Staphytococcusatreusinfoodsmostprobablenumbermethodforisolationand cnumcration)，第三法修改采用国际分析家学会（AOACINTERNATIONAL)AOAC2003.07&加T食品中金黄色葡葡球菌计数Peirifiln测成片法》(20a3年）(A0ACOfficialMethod2003.07,3MTMPetrifilmTMstaphexpresscountplate method for thc enumeration of Sta phyiacuceus aureus in selecied lypes of processcd and prcparedfoods;collaborativc study）、A0AC 2003.08《乳制品中金黄色葡萄球菌计数Petrifilm测试片法(2003年)(AOAC Official Method 2003.08.3MTMPetrifilmTM Staph cxpress count platemethod forthc cnumcration of Staphyiocarcus aureus in selected dairy loods),AOAC 20o3.1l肉水产品和禽中金黄色葡荷球菌计数Pelrifilm测试片法》（2003年）（A0ACOlicialMethod 2003，11，3MrMPetri-filmTM staph express count plate mcthod for the cnumeration of Staphylococcus aureus in sclectedtypes of meats,scafood and poultry),本标准的第法与A0AC975.55和IS06888-1:1999的主要区别如下：将A0AC样品制备时取样50g（或50mL)修改为25g（或25mL);-修改了ISO的计算公式。
本标准的第二法与 A0AC 987. 09的毛要区别为:将样品制备时取样量 50 g(或 50 mL)修改为 25 g(或25tmL）
本标准的第三法与A0AC2003.07、AOAC2003.08,A0AC2003.11的主要区别如下：将测试片的培养温度35℃±1℃或 37℃±1℃统一为36℃±1℃，规定了测试片上需确认的可疑菌落。本标准自实施之日起CB/T4789.10一2003中金黄色葡萄球菌计数部分同时废止。本标推的附录 A和附录B为规范性附录。本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。本标准由中华人民其和国卫生部负责解释。本标准负责起草单位：中国疾病预防控制中心营养与食品安全所。本标准参与起草单位：上海市疾病预防控制中心，中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局、中华人民共和国内蒙古出人境检验检疫局、江苏省疾病预防控制中心。本标推主要起草人：刘秀梅、陈敏、刘弘、卢行安、刘中学、袁宝君、田静。1范围
食品卫生微生物学检验
金黄色葡萄球菌计数
本标雅规定了食品中金黄色葡萄球菌的计数方法。GB/T 4789.37—2008
本标准适用于食品利食物中毒样品中金黄色葡帮球菌的计数。其中第-法适用于金黄色葡药球菌含量较高的食品；第二法适用于金黄色葡萄球菌含量较低而杂菌含量较高的食品，第三法适用于肉及其制品、奶制品等。
2设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：2.1恒温培养箱：36℃±1℃。
2.,2 冰箱:2 ℃~5 ℃
2.3 恒温水浴箱:37 ℃±1 ℃。2.4天平：感量0.1g
2.5均质器。
2.6振荡器。
2.7无菌吸管:1 mL(具 0,01 mL刻度),10 mL(具 0.l ml.刻度)或微最移液器及吸头。2.8无菌锥形瓶：容量100mL.500mL。2.9无菌培养Ⅲ：直径90mm.
2. 10 无菌 1. 型涂布棒。
2. 11pH计或pH 比色管或精密 pH试纸。3培养基和试剂
3. 1胰酪陈大臣肉汤:见第 A.1章3.2Baird-Parker 琼脂平板见第 A, 2 章，3.3脑心浸出液（BIII)肉汤：见第A.3章，3.4兔血浆：见第A.1章。
3.5磷酸盐缓冲液:见第A.5章。
3.6营养琼脂斜面:见第 A.6 章。3.7革兰氏染色液：见第A,7章。3.8无菌生理盐水：称取8.5g氯化钠溶于1000mL蒸馅水巾，121C高压灭菌15min。3.911nol/T.氢氧化钠（NaOII)：称取40g氢氧化钠溶于1000mL蒸馅水巾3.101mul/L盐酸（HCl)：移取浓盐酸90mL，用蒸馏水稀释至1.000mL。3.11PetrifilmTM1金黄色葡葡球菌测试片。1）PelrifilmTM是由3M公司提供的产品的商品名。给出这一信总是为方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效的产品。1
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4检验程序
检验租序见图1。
5操作步骤
5.1样品的稀释
Baird-Parker平板计数
第一法
25g（或25ml.）样品一225ml.稀释液，均质10倍系列稀释
选择 3个连续的适宜浓度的样品液,接种 Bairdl-Parkcr平板36 ℃-1c
45 h-48 h
计数及血浆凝固酶试验
图1金黄色葡萄球菌Baird-Parker平板法检验程序5.1.1固体和半固体样品：称取25g样品置盛有225ml.磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000r/min~100001/min均质1min~2min，或置盛有225mL稀释渡的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min～2 min,制成1：10 的样品句液。5.1.2液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品，置盛有225ml磷酸盐缓冲液或牛现盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混勾，制成1：10的样品勾液。5.1.3用1ml.尤菌吸管或微量移液器吸取1：10样品勾液1mL,沿管壁缓慢注于盛有9mL稀释液的无菌试中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用一支1mI.无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1：100的样品匀液。5.1.4按5.1.3操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用-次1mL无菌吸管或吸头。
5.2样品的接种
根据对样品污染状况的估计，选择2个～3个适宜稀释度的样品勾液（液体样品可包括原液），在进行10倍递增稀释时，每个稀释度分别吸取1mL样品匀液以0.3mL.0.3ml0.4mL接种量：分别加入三块BuirdParkcr平板，然后用无菌L棒涂布整个平板，注意不要触及平板边缘，使用前，如Baird-Purker乎板表面有水珠，可放在25℃～50℃的培养箱里燥，直到平板表面的水珠消失，2
ht
5.3培养
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在通常情况下,涂布后,将平板静置J0 min,如样液不易吸收，可将平板放在培养箱 36 ℃土1℃暗养 1h;等样品勾液吸收后翻转乎而,倒置于培养箱,36℃+1℃培养,45 h～48h。5.4典型菌落计数和确认bZxz.net
5.4.1金黄色萄球菌在Baird-Parker平板F,菌落圆形、凸起、湿润，直径为2mm-~3mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落有似奶油至树胶样的硬度，偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落；但无混独带及透明圈。长期保行的冷炼或·上燥食品中所分离的菌落比典型菌落所产牛的黑色较淡些，外观可能粗糙并燥。5.4.2选择合计菌落数在20～200的平板,计算典型菌落数。如果：a）最低稀释度平板的菌落小于20,计数该稀释度平板上的典型菌落。b）某一稀释度平板的菌落大于200且有典型菌落，但上一稀释度平板上没有典型菌落，计数该稀释度平板上的典型菌落。
c）某：稀释度平板的菌落大于200且有典型菌落，且上一稀释度平板上有典型菌落，其平板上的菌落数不在20～200之闻,计数该稀释度平板上的典型菌落。以上按式(1)计算。
d）平板菌落数均在 20～200 之间,按式(2)计算。5.4.3从典型菌落中在选五个菌落(小于五个全选）,分别接种到5mL BHI肉汤和营养琼脂斜面，36 上1 ℃培养 18 h-~24 h.
5.4.4取新鲜配置免血浆0.5mL，放人小试售，再加人5.4.3BHl培养物0.2mL~0.3mL，振荡摇匀，置36℃土1℃恒温培养箱或水浴内，每半小时观察一次，观察6l.如呈现凝固（即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块)或疑固体积大于原体积的一半，判定为阳性结果。同时以血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌株的肉汤培养物作为对照。也可用商品化的试剂，按说明书操作，进行凝固酶试验。5.4.5如实验结果可凝，挑取营养琼脂斜面的菌落到5mLBIII肉汤，36℃土1℃培养18h-48h，重复5.4.4.
6结果计算
式(1):
T = AB/Cd
式中：
样品中金黄色葡萄球菌菌落数；T
某一稀释度典型菌葬的总数;
某一稀释度而浆凝固阳性的菌落数：C一一某一稀释度用于血浆凝固酶试验的菌葬数;d-—某—稀释度。
武(2)：
N = ZT/1. 1d
式中：
N样品中金黄色葡萄球菌菌落数：>T——平板上所有金黄色葡萄球菌菌落数之和；1. 1——计算系数:
d一—-稀释凶子(第一稀释度)。7金黄色葡萄球菌平板计数的报告(12
（2）
根据Baird-Parker平板上金黄色葡萄球菌的典型菌落数，按第6章中公式计算，报告每克（或毫升）GB/T 4789.37--2008
样品中金黄色葡荷球菌数,以 CFU/g(或 CFU/nL)表示;如 T或 N值为 0,则以小于1乘以最低稀释倍数报告。
第二法金黄色葡萄球菌MPN计数
8检验程序
检验程序见图 2。
25g(或25mL）样品-225mL稀释液.均质10 倍系列稀释
选择3个适宜稀释度的样品匀液，各汲取？mI.分别接种于3管嵌酪膀豆肉汤36 -1 ℃
45 h~-48 h
接种Baird-Parker平板
36 ℃+1℃
45 h~48 h
血浆凝固酶试验
查MPN表
报告结果
图2金黄色葡萄球菌MPN法检验程序9操作步骤
9. 1样品的稀释
按 5. 1进行。
9.2接种和培养
9.2.1根据对样品污染状况的估计，选择3个适宜稀释度的样品勾液（液体样品可包括原液），在进行10倍递增稀释时，每个稀释度分别吸取1ml.样品句液接种到姨酪陈大肉汤管，每个稀释度接种3管，将上述接种物36℃±1C培养，45h~48h。9.2.2用接种环从有细菌生长的各管中，移取1环,分别接种Baird Parkcr乎板，36℃=1C培养，15 h-v48 h.
http:
9.3典型菌落确认
9. 3. 1见 5. 4. 1 。
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9.3.2从典型菌落中至少挑取1个菌落接种到BHI肉汤和营养琼脂斜面，36℃士1℃培养18h~24h。进行血浆凝固酶试验（见5.4.4.5.1.5），10结果计算
计算血浆凝固酶试验阳性菌落对应的管数，弯MPN检索表（见附录B)11金黄色葡萄球茵最可能数(MPN)的报告根据检索表的数值，报告每克（或毫升）样品中金黄色葡萄球菌的最可能数，以MPN/g（MFN/mL）表示。
第三法金黄色葡萄球菌Petrifilm测试片法12检验程序
检验程序见图3。
25g（或25mL)样品|225mL稀释液，均质10倍系列稀释
选择2个～~3个连续的适宜浓度的样品勺液，各取1mL,分别加人FetririlmTM纸片判读
无菌落生长
仅有典型紫红色菌落
紫红色菌落计数为金黄色
葡萄球菌
除典型紫红色菌落外其他颜色的萄落在测武片上叠人确认反应片后
36'Cl1C培养1 h--3 h
粉红色景圈的菌落计数为金黄色葡葡球菌
函3金黄色葡萄球菌PetrifilmTM测试片法检验程序
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13操作步骤
13.1样品稀释
按照5.1.[～5.1.2制备1：10样品勾液后，用1mol/L氢氧化钠(NaOH)或1mol/L盐酸（HCl）调节该样品匀液的pH至6.心~·8.0。13.2接种和培养
选择2个～3个适宜稀释度的样品勾液，每个稀释度接种两张测试片。将测试片置于平坦实验台面处，揭开上层膜，用吸管吸样品勾液1m工垂直滴加到一张测试片的中央，将上层膜缓慢盖下，避免气泡产生，切勿使上层膜直接落下，将压板放置在上层膜中央处，轻轻地压下，使样液均勺覆盖于圆形的培养面积上，切勿扭转或动压板，拿起压板，静置牵少1min以使培养基避固。将测试片的透明面朝上置于培养箱内，堆登片数不超过20片，36℃土1℃下培养24h±2h，培养24h+2h后，如果测试片上没有菌游生长或菌落全部是典型紫红色，检验完毕；如果培养24h士2h时测试片上出现除典型紫红色以外额色的菌落，如黑色、蓝绿色等，需使用确认反应片作逊一步确认。13.3确认反应
当需要使用确认反应片时，将上层膜掀起，将确认反应片置入测试片的培养范围内、再将上层膜放下双盖在确认反应片上，用于指以动的方式轻轻将测试片与确认反应片玉紧，包括确认反应片的边缘，此步骤可使测试片与确认反应片紧密接触并除去气泡，最后把插人确认反应片的测试片放在36℃十1‘c的培养箱内培养1h～3h，
14结果计算与报告
14.1判读
培养24h士21时在测试片上吴典型紫红色的菌落为确认的金黄色葡萄球菌，无需用确认反应片作进一步确认，如果培养21h士2h时出现典型紫红色以外的其他菌落，需用确认反应片进行确认，有粉红色晕圈的菌落为金黄色葡萄球菌。没有粉红色晕圈的菌落不是金黄色筋萄球菌，不应被计数。如果整个培养面积呈粉红色而没有明显的晕圈，说明金黄色葡葡球菌大最存在，结果记录为“多不闻计”，然后进一步稀释后重新检验。
14.2金黄色葡萄球菌测试片计数的报告培养时间一到应立即计数，可目测或用放大镜辅助计数，选择菌落数在15～150之间的稀释度，两张测试片菌落平均数乘以稀释倍数，即为每克（或毫升）样品中金黄色葡萄球菌数，以CFU/g（CFU/mL）表尔。
如果所有稀释度测试片上的菌落数都小于15，计数稀释度最低的测试片上的菌落数乘以稀释倍数报告：如果所有稀释度的测试片上均无菌落生长，以“小于1乘以最低稀释倍数”报告；如果所有稀释度的菌落数都大于150，计数最高稀释度测试片上的菌落数乘以稀释倍数报告。计数菌落数大于150的测试片时，可计数一个或两个具有代表性的方格内的菌落数，换算成单个方格内的菌落数后乘以30即为测试片上估算的金黄色葡葡球菌数（圆形生长面积为30cm）。6
胰酪陈大豆肉汤
A. 1. 1 成分
胰酪陈(或胰蛋白陈)
植物蛋门陈（或大豆蛋白陈）
氯化钠
磷酸氢一钾
酮酸钠
葡萄糖
蒸馏水
PH7.3±0.2
A.1.2制法
附录A
（规范性附录）
培养基制备
1 000 L
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将上述成分混合，加热，轻轻搅拌并落解，调节pH，分装10ml于16mm×150mtm试管内，121高压灭菌15min。
A.2 Baird-Parker 琼脂平板
A.2. 1成分
胰蛋白陈
牛肉膏
酵母苷
丙酮酸钠
甘氮酸
氯化锂(LiC1·6H,O)
蒸馏水
pH7.0±0.2
A.2.2增菌剂的配法
30%卵黄盐水 50 mL与除菌过滤的1%亚碲酸钾溶液10 mL混合,保存于冰箱内。A.2.3制法
将各成分加到蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解。冷却至25℃，调节pH。分装每瓶95mL，121℃高压灭菌15min.临用时加热溶化琼脂，冷至50℃，每95ml.加入预热至50℃的卵黄亚碲酸钾增菌剂5mL摇匀后倾注平板。培养基应是致密不透明的。使用前在冰箱储存不得超过48h。A,3脑心浸出液(BHI)肉汤
A,3.1成分
胰蛋白质陈
氯化钠
磷酸氢二钠(NaHPO,12IO)
http:
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葡萄糖
牛心浸出液
pH7.4±0,2
A.3.2制法
加热溶解,调节 pH,分装6 mm×15U mm试管,每管5 mL 置121℃,15 min 灭菌。A,4兔血浆
取柠檬酸钠3.8g,加蒸馏馅水100 mL，溶解后过滤，装瓶121℃高压灭菌15min。兔血浆制备：取3.8%柠檬酸钠溶液·-份加免（人）全血四份，混好静置之（或以3000r/min离心30 min),则使血液细胞下降，即可得血浆。A.5磷酸盐缓冲液
A.5.1成分
磷酸二氢钾(KH,PO4）
蒸馏水
A.5.2制法
贮存液：称取34.0g的磷酸二氢钾溶于500mL热馏水中，用人约175mL的1mol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.2,用热增水稀释至1000mL后存于冰箱。稀释液：取贮存液1.25mL，用蒸馏水稀释至1000mL，分装丁适宜容器中，121℃高压灭菌15min
A.6营养琼脂斜面
A.6.1成分
蛋白陈
牛肉膏
氯化钠
蒸馏水
pHI7. 2-~7. 4
A.6.2制法
15 g～~20 g
1 000 tmL
将除琼脂以外的各成分溶解于蒸馏水内，加人15%氢氧化钠溶液约2mL校正pH至7.2~7.4.加入琼脂，加热煮沸，使琼脂熔化，分装13mm×130加小试管，121℃高压灭菌15min。A.7革兰氏染色液
A.7.1结鼻紫染色液
A,7. 1. 1 成分
结晶紫
95%乙醇
1%草酸铵水溶液
A.7.1.2制法
将结品紫完金溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。8
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A.7.2革兰氏碘液
A.7.2.1 成分
碘化钾
蒸馏水
A.7.2.2制法
300.0 ml.
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将碘与碘化钾先行混合，加入蒸馏水少许充分振摇待完全溶解后,再加蒸馏水至300 mI.。A.7.3沙黄复染液
A.7.3.1成分
95%乙醇
蒸馏水
A.7.3. 2制法
将莎黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。4.7.4染色法
A,7. 4.1涂片衣在火焰上固定,滴加结晶紫染液,染1 min,水洗。A.7.4.？滴圳革些氏碘液，作用1 min,水洗。A.7.4.3滴加95%乙醇脱色约15s-~30§,直至染色液被洗掉，不要过分脱色，水洗，A,7.4.4滴加复染液，复染1 min.水洗,待干,镜检。全品伙伴网
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附录B
（规范性附录）
金黄色葡萄球菌最可能数（MPN)检索表每克(或毫升)检样中金黄色葡萄球菌最可能数(MPN)的检索见表B.1，表B.1金黄色葡萄球菌最可能数（MPN)检索表阳性管数
0, 001
95%置信区间
阳性管数
95%性信区间
证1：本表来用3个稀释度[0,1g(或0.1ml.),0.01g（或0.01mL)和0.001g(或0.001nL)],每个稀释度接种3管。
注2：表内所列检样基如改用1g（或1ml.)、0.1g(或0.1mL)和0.01g(或0.01ml.)时，表内数字应相应降低10倍；如用0.01g（或0.01ml.)、0,001g（或0.001mL),0.0001g（或0,0001mL)时，表内数字应相应增高10倍，其余类摘
http:
ungfoodmatepe
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