【国家标准(GB)】 食品卫生微生物学检验 双歧杆菌检验

ICS 07. 100. 30
中华人民共和国国家标准
GB/T 4789.34—2008
代替 GB/T 4789.342003
食品卫生微生物学检验
双歧杆菌检验
Microbiological examination of food hygiene-Examination of Bifidobacterium2008-12-03发布
中华人民共和国卫生部
中国国家标准化管理委员会
2009-03-01实施
GB/T 4789.342008
双歧杆菌检验》。
本标准代替G13/T4789.34--2003%食品卫生微生物学检验本标准与GB/T4789.34—2003相比主要修改如下：将选择性分离培养基由TFY和 BL培养基修改为BBL培养基(改良番茄汁琼脂培养基);-增加API50CH诊断试剂盒；
增加果糖-6-磷酸盐磷酸酮酶(F6PPK)测定。本标准的附录 A 、附录 13 为规范性附录。本标准由中华人民其和国卫生部提出并归口。本标准出中华人民共和国卫生部负责解释。本标准起草单位：中国疾病预防控制中心营养与食品安全所。本标雅主要起草人：徐逊、刘秀梅、杨宝兰、李志刚、杨大进、方从容。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：GB 4789. 34 1996,GB/T 4789.34 2003.合品成伴网httn：/
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1范围
食品卫生微生物学检验
双歧杆菌检验
本标谁规定了食品中双歧杆菌的检验方法。本标准适用于食品中双歧杆菌的检验。2设备和材料
除微生物实验空常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下。2.1恒温培养箱：36℃土1℃。
2.2气相色谱仪配 FID 检测器。2.3冰箱:2℃-~5℃。
2.4天平：感量0.1g。
2.5 元菌试管:18 mmx180 mm,15 mm×100 mm。GB/T 4789.34—2008
2.6无菌吸管:1 ml(具 0.01 ml 刻度）、10 ml(具 0.1 mL刻度)或微量移液器(200 μL～1 000 μL)及配套吸头。
2.7无菌锥形瓶：500mL、250mL。3培养基和试剂
3.1BBL培养基：见第A.1章。
3.2PYG培养基：见第 A.2章。
3.3TPY培养基:见第 A.3竞。
3.4API50CH生化鉴定试剂盒1。
3.5半胱氨酸：化学纯，
3.6氟化钠：化学纯。
碘乙酸钠或碘乙酸钾：化学纯。3.7
3.8果糖-6-磷酸盐:化学纯。
3. 9盐酸羟胺(hydroxy lamine HCl):化学纯三氯乙酸(TCA)化学纯。
三氯化铁(FeCl·6H,0)：化学纯。3. 11
3、12
甲醇:分析纯。
三氯甲烷：分析纯，
3.14硫酸：分析纯。
3.15冰乙酸：分析纯。
乳酸：分析纯。
3.17乙酸标准溶液：吸取分析纯冰乙酸5.7mL，移人100ml.容量瓶中，加水至刻度，标定，标定方法见B.2.2.1，此溶液浓度约为1mol/L.。1）由法国生物梅里埃公司提供的产品的商品名。给出这一信息是为丁方使本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效的产品。1
合品成伴网
GB/T 4789.34—2008
3.18乙酸标推使用液：将经标定的乙酸标准溶液用水稀释至0.01 mol/L，3.19乳酸标准溶液：吸取分析纯乳酸8.4mL.移人100mL容量瓶中，加水至刻度，标定，标定方法见B. 2. 2. 3,此溶浓度药为 1 mol/L。3.20乳酸标雅使用液：将经标定的乳酸标推溶液用水稀释至 0.01 mo1/1.。4捡验程序
双歧杆菌检验程序见图1。
样品25g（25mL）-225mL灭菌生理盐水10倍系列稀释
选择2个~3个适当稀释度各以0.1m1.加入到HHI,琼脂平板进行涤布厌氧，48
36 ℃±1 ℃Www.bzxZ.net
挑取可疑落接种FDBL琼脂平板
接种PYG液体培养基
厌氧，48 h
36 c±1 ℃
测定乙酸、乳酸
5操作步骤
5.1样品制备
生化反应
接种TPY液体培养基
革兰氏染色，过氧化氢酶试验
菌落讨数
厌氧，72h
36 ±1
定果糖-6-磷酸盐磷酸耐酶
图1双歧杆菌检验程序
5.1.1样品的全部制备过程均应遵循无菌操作程序5.1.2以尤菌操作称取25g（或25mlL)样品，置于装有225mL生理盐水的灭菌锥形瓶内，制成1：10的样品勾液。
5.2稀释步骤
5.2.1用1ml.无菌吸管或微量移液器吸取1：t0样品勾液1.0ml.,沿管壁缓慢注于装有9mL生理盐水的无菌试管中（注意吸答尖端不婴触及稀释液），振摇试管或换用1支无菌吸誉反复吹打使其混合2
http:
均匀，制成1：100的样品匀液。GB/T 4789.34—2008
5.2.2另取1ml.无菌吸管或微量移液器吸头，按上述操作顺序，做10倍递增样品液，每递增稀释-次，即换用1次1mL灭菌吸管或吸头。5.2.3根据对待检样品双歧杆菌含量的估计，选择三个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取0.1ml稀释液于BBL琼脂平板，使用火菌L形棒进行表面涂布，每个稀释度做两个平板。厌氧,36℃工1℃培养48h土2h，培养后选取菌落数在30300之间的平板进行计数，从样品稀释到平板涂布要求在15 min 内完域。
5.3纯培养
挑取 3个或以,上的可疑菌落接种于BBL琼脂平板,厌氧,36℃+1℃ 培养 48 h。5.4镜检及生化鉴定
5.4.1涂片镜检：双歧杆菌菌体为革兰氏染色阳性，不抗酸、无芽孢，无动力，菌体形态多样，呈短杆状，纤细杆状或球形，间形成各种分支或分叉形态。5.4.2AP150CH生化鉴定试剂盒鉴定：选取纯培养平板上的三个单个菌落，分别使用API50CH生化鉴定试剂盒进行牛化反应检测，不同双歧杆菌菌种主要生化反应见表1。表1双歧杆茵菌种主要生化反应
赤癣醇
D-阿拉伯糖
1-阿拉伯糖
D核糖
D-木糖
1-沫糖
阿东醇
β甲基·D·木辨武
D·半乳
D葡萄糖
D-果糖
D-甘馕铺
山梨糖
L-鼠李糖
卫矛醇
甘鳞醇
山梨醇
甲基-D-廿露糖
两豉双歧杆菌婴儿双歧杆菌
(B.bifidum)
(B.infantis)
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长双歧杆菌
(B.longum)
青春双歧托菌
(B.adolescentis)
动物双歧杆菌
短双歧杯菌
(B.mimalis)
(B. breve)
GB/T 4789.34—2008
甲基D葡蛋糖
N-乙-葡萄糖胺
苦杏仁球(扁桃成）
熊果戒
七叶灵
水杨武（柳醇）
I) 纤维二,糖
D-麦芽糖
L-乳糖
L-蜜二糖
I) 海糖(覃糖)
菊糖（菊根粉）
D-松兰糖
棉籽糖
肝糖(糖原)
木糖醇
龙胆二糖
D崧二糖
D-来苏糖
D-塔格糖
D-岩糖
I-岩糖
D阿瓣醇
「-阿糖醇
葡糖酸钠
2-削基·葡萄糖酸钠
5.酮苯葡萄糖酸钠
表1（续）
两歧双歧杆菌婴儿双歧杆菌
(B. bifidum)
(B. infantis)
长双歧杆菌
育春双歧杆菌
(B. longun) (B. atptescenis)+
动物双歧杆菌
(B.unimalis)
注：十表示90%以上菌株阳性；一表示90%以上菌株阴性；d表示11%~89%以上菌株阳性，http:
短双歧杆菌
(B. breve)
5.5果糖-6-磷酸盐磷酸酮酶(F6PPK)的测定，见第B3.1章5.6气相色谱法测定双歧杆菌的有机酸代谢产物，见第B.2章。6报告
GB/T4789.34—2008
根据5.4镜检及生化反应结果、5.5果糖-6-磷酸盐磷酸酮酶(F6PPK)阳性结巢和5. 6双歧杆菌的有机酸代谢产物乙酸与乳酸微摩尔之比大于1,报告双歧杆菌属的种名。5
http://foodmate.netGB/T4789.34—2008
A.1BBL琼脂培养基
A. 1. 1成分
蛋白陈
酵母浸膏
葡葡萄糖
可洛性淀粉
氯化钠
西红浸出液
证温80
琼脂粉
蒸馏水
A.1.2制法
附录A
【规范性附录】
培养基
15.0g~20.0g
1 000 rnl
A.1.2.1半胱氮酸盐溶液的配制：称取半胱氮酸0.5g，加人1.0ml.盐酸，使半胱氨酸全部溶解，配制成平胱氨酸盐溶液。
A.1.2.2西红柿浸山液的制备：将新鲜的西红柿洗净后称重切碎，加等量的蒸缩水在100℃水浴中加热，搅拌90min，然后用纱布过滤，校正pH7.0,将浸出液分装后，121℃高压或菌15min～20min。A.1.2.3将A.1.1所有成分加入蒸馏水中，加热溶解，然后加人半胱氨酸盐溶液，校正pH6.8上0.2。分装后121℃高压灭菌15min～20min。临用时加热熔化琼脂，冷至50℃时使用。A,2PYG液体培养基
A,2.1成分
蛋白陈
葡萄糖
酵母粉
半胱氨酸-HCl
盐溶液
维牛素K,溶液
氯化血红素溶液(5g/mL）
蒸馏水
A,2. 2制法
1 00 mL
A.2.2.1盐溶液的配制：称无水氯化钙0.2g、硫酸镁0.2g、磷酸氨二钾1.0多、磷酸-氢钾1.0g、碳酸氢钠10.0g、氯化钠2.0g，加蒸馏馅水至1000mL。A.2.2.2氯化血红素溶液(5mg/ml.)的配制：称取氯化血红素0.5g溶丁1mo1/L氢氧化钠1. 0mL中，加蒸馏水至1000mL，121℃高压灭菌15min20min。A.2.2.3维生素Kl溶液的配制：称取维生素Kl1.0g，加无水乙醇99mL，过滋除菌，冷藏保存。A,2.2.4除氯化血红素溶液和维生素K，溶液外，A,2.1其余成分加人蒸馏水中，热溶解，校正G
品成伴网h
CB/T 4789.34--2008
pH6.0，加入中性红溶液。分装后121℃高压灭菌15min～20min。临用时热熔化琼脂，加入氯化面红素溶液和维生素K，溶液，冷至50℃使用。A.3 TPY 液体培养基
A.3.1成分
水解酪蛋白
植物滕
酵母粉
葡葡糖
磷酸氢一钾(K,HPO,7H,O)
氯化镁（MgClz·6Hz0)
硫酸锌(ZnSO·7H,O)
氯化钙（CaCl,）
氯化铁（FeCl）
吐温-80
蒸馏水
A.3.2制法
1 000 mL
A.3.2.1半胱氨酸盐溶液的配制：称瑕半胱氨酸0.5g，加入1.UmL盐酸，使半胱氨酸全部溶解，配制成半胱氨酸盐溶液。
A.3.2.2将A.3.1成分加热溶解，然后加入半既氮酸盐溶液，校正pH6.5士0.1.分装后121℃高压灭菌 15 tnin~20 min.
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GB/T 47B9.34—2008
附录B
（规范性附录）
果糖-6-磷酸盐磷酸酮酶与双歧杆菌的有机酸代谢产物检测方法B.1果糖-6-磷酸盐磷酸酮酶(F6PPK)定B.1.1试剂
a）0.05 mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.5)+500 mg/1.半胱氨酸-HCl。h）6tug/nL氟化钠+10mg/mL碘乙酸钠或钾。c）果糖-6-磷酸盐（钠盐，70%~98%纯度）80mg/mL水溶液，d）盐酸羟胺（hydroxylamine-IICl）139mg/rnL水溶液，使刑时以氢氧化钠中和至pH6.5。e）15g/100mL三氯乙酸（TCA）水溶液。f)4mal/L盐酸。
g）0.5g/100ml氯化铁(FeCl.-6H.0)溶于0.1mol/L盐酸中。B.1.2检测步骤
挑取BBL琼脂板上纯培养的双歧杆菌接种到TPY液体培养蒸，灰氧，36℃士1℃培养72h士3h，取10mLIPY培养液十3000r/min离心5min，弃上清液，细胞用.l:述试剂a)洗涤2次，然后悬浮于1.0mL试剂a)中。将盛有细胞悬液的容器置于一冰浴内，用超声波处理20min，以破碎细胞。然后在超声波处理物中加人试剂b）和试剂c)各0.25ml，置于37C保温30min。保温后在溶液中加人1.5ml.试剂d),置室溢5min。加人试剂e)和试剂I)各1mL,置室温5rui。然后加入1mI.试剂g)观察溶液颜色：
B.1.3结果判定
经以上程序测定如显红褐色或红紫色，则果糖-6-磷酸盐磷酸酮酶为阳性，否则为阴性。B.2气相色谱法测定双歧杆菌的有机酸代谢产物B,2.1双歧杆菌培养液制备
挑取BBL琼脂平-板上纯培养的双歧杆菌接种丁PYG液体培养基，同时用未接种菌的PYG液体培养基做空白对照，灭氧，36℃士1℃培养48h。B.2.2标准液的配制
B.2.2.1乙酸标准溶液：准确吸取乙酸5.70mL，加水稀释至100.0ml，摇匀，进行标定，配成约1.0mol/L的乙酸标准溶液，标定方法为：准确称取乙酸3g，加水15mL，酚敲指尔液2滴，用1mol/mL氢氧化钠溶液滴定，并将滴定结果用空白试验校正。1mL1mol/mL氢氧化钠溶液相当于60. 05 mg的乙酸。
B.2.2.2乙酸使用液：将经标定的乙酸标准溶液用水稀释至20.0mmol/L。B.2.2.3乳酸标准溶液：准确吸取含量为85%～90%的乳酸0.841mL，加水稀释至100.0mL，摇匀，配成1.0mol/L的乳酸标准溶液。标定方法为：准确称玻乳酸1g，加水50ml,加人1mol/ml.氢氧化钠滴定液25mL，燕沸5min，加入酚酸指示液2滴，同时用0.5mol/ml.硫酸滴定液滴定，并将滴定结果用空白试验校正。1mL1mol/ml.氢氧化钠溶液相当于90.08mg的乳酸，B.2.2.4乳酸使用液：将乳酸标准溶液用水稀释至20.0mmol/L.B.2.3方法
B.2.3.1乙酸的处理
双歧杆菌培养液2.0mL~3.0mL放人10mL离心管中，加人0.2mL50%(体积分数）硫酸溶8
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液,混勾,加人 2.0 ml.内酮,混勾后加过量氯化钠,剧烈振摇 1 min.再加人2. 0 mL乙醚，振摇 1 min后,于3000 r/min 离心5 min,将上清液转人另--试管中，下层溶液用2,0 mL丙酮和2.0 rnL 乙醚重复提取2次,合并有机相，于 40℃水浴中用氮气吹至少量溶液存在,用内酮定容至1. 0 mL,混匀后备用同样操作步骤处理乙酸标推稚空白培养液。B. 2. 3. 2乳酸的处理
取双歧杆菌培养液2.0mL~3.0mL放入10ml.比色管中，100℃水浴10min，加人0.2mL50%（体积分数)硫酸溶液，混匀，加人1.0mL甲醇，于58℃水浴30min后加水1.0ml，加三氯中烷1. 0 ml.,振摇 3 min,3 000 r/min 离心 5 min,取三氯甲烷层分析。同样操作步骤处理乳酸标准和空白培养液。
B.2.3.3气相色谱条件
色谱柱：长2m、内径4mm的玻璃柱，填装涂有20%邻苯二甲酸二王酯（DNP)十7%吐温60的chramiasorbwHP(80国～100目);柱温;110C;汽化室:150 ℃;检测器:150 ℃;载气(氮气):50 mL/min;进样量：1.0μL：外标法峰面积定量。B.2.4结果计算
按式(B. 1)计算
式中：
An—Ag
样品培养液中乙酸或乳酸的含量，单位为微摩尔每亳升（umol/ml)；x
一样品培养液中乙酸或乳酸的峰面积；空白培养液中艺酸或乳酸的峰面积；乙酸标推或乳酸标准的峰面积；c-乙酸标准或乳酸标的浓度，单位为微摩尔每毫升（μmol/mL）。B.2.5允许差
相对偏差≤15%。
B. 2. 6 结果判定
如果乙酸（μmol/mL）与乳酸（μl/m）比值大于1，可判定为是双歧杆菌的有机酸代谢产物。B.2.7气相色谱图
乳酸和乙酸标准色谱图分别见图B,1和图B.2.图B.1乳酸标准色谱图
ht
乙酸标准色谱图
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食品卫生微生物学检验
双歧杆菌检验
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开本 880×1230 1/16印张 1字数 19 千字2009年3月第一版2009年3月第一次印刷x
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