【国家标准(GB)】 食品卫生微生物学检验 阪崎肠杆菌检验

ICS 07. 100. 30
中华人民共和国国家标准
GB/T 4789.40—2008
食品卫生微生物学检验
阪崎肠杆菌检验
Microbiological exanination of food hygiene-Examination of Enterobacter sakazakit2008-11-21发布
中华人民共和国卫生部
中国国家标准化管理委员会
2009-03-01实施
中华人民共和国
国家标准
食品卫生微生物学检验
阪崎肠杆菌检验
GB/T 4789. 40-- 2008
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GB/T 4789.40—2008
本标准的第一法修改采用国际标准化组织（IS(O)ISO/TS22964：2006《乳和乳制品中版崎肠杆菌》（Milkandmilkproducts—DctertionafEnterobactersakazakii）的检验方法，第一法参考美国食品药品管埋局（FDA)婴儿配方粉中版崎肠杆菌的分离和计数》[lsolationand enumerationofEnterobactersakazakiifromdehydratedpowdered infant formula(July202）i的检验方法本标准与ISO方法的区别如下：
-培养温度由 37℃±1 ℃改为 36 ℃±1 ℃;-阪崎肠杆菌选择性分离平板由ESIA改为DFI，培养温度由44℃士1℃改为36℃上1℃；第一法中确定 100 g(或 100 mL)为基本检测单位;增加了第二法，作为版崎肠杆菌检测的MPN定量检测方法。本标准的附录 A、附录 B为规范性附录。本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口，本标准由中华人民共和国卫生部负贡解释。本标推起草单位：中国疾病预防控制中心营养与食品安全所。本标推主要起草人：刘秀梅、裴晓燕、郭云吕。全品成伴网ht：
1范围
食品卫生微生物学检验
阪崎肠杆菌检验
本标准规定了食品中阪崎杆菌的检验方法。本标雅适用于婴幼儿配方食品，乳和乳制品及其原料中版畸肠杆菌的检验。2设备和材料
除微牛物实验室常规灭菌皮培养设备外，其他设备和材料如下：2. 1恒温培养箱:25℃1 ℃,36 ℃±1℃,44℃±0,5℃。冰箱:2 ℃~5 ℃,
2.3恒温水浴箱：44℃士0.5℃，2.4
天平；感量0.1g。
2.5均质器。
2.6振荡器。
GB/T 4789.40—2008
无菌吸管:1 mL(具0.0l ml.刻度）,10 mL(其 0.1 mL刻度)或微量移液器及吸头。2.8光菌锥形瓶：容量100mL、200mL、2000mL无菌培养瓜L：直径90mm。
2.10pH计或pH比色管或精密pH试纸。2.11VITEK全白动微生物鉴定系统\。3培养基和试剂
3.1缓冲蛋白陈水(bufferpeptoncwater，BPW)：见第A,1章。3.2改良月桂基硫酸盐胰蛋白陈肉汤-万古霉素（modificdlaurylsulfatetryptosebrotb-vancomycinmedium,mLSI-Vm).见第A.2章。
3.3阪崎肠杆菌显色培养基（druggan-forsythe-iversen,DFI)\）琼脂：见第A.3章。3.4胰蛋白陈大豆琼脂（trypticasesoyagar，TSA)：见第A.1章。3.5API20E生化鉴定试剂盒\。
3. 6 氧化酶试剂:见第 A, 5 章。3.7L-赖氨酸脱羧酶培养基：见第A.6章。3. 8 L-岛氨酸脱发酶培养基:见第 A. 7 章。3.9L-精氨酸双水解酶培养基：见第A,8章。3.10糖类发酵培养基：见第A.9章。3.11西蒙氏柠檬酸盐培养基：见第A.10章。由法国生物梅里埃公可提供的产品的商品名。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品1）bzxz.net
的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效的产品。2）由美国（)xoid公司提供的产品的商品名。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效的产品。1
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GB/T 4789.40—2008
4检验程序
检验程序见图1。
5操作步骤
5.1前增菌和增菌
第一法
阪崎肠杆菌的检验
检样100（或100ml.）
+BPW稀释滋900mL
36 C±1 C, 18 h±2 h
ml.+ml.S1-Vm 10 ml.
44c±0.5C,24h±2h
DFI琼脂
36±1℃，24 h±2 h
挑取蓝绿色菌落
25 ℃±1 C, 48 l±4 h
挑斑黄色菌落
生化鉴定
图1阪崎肠杆菌检验程序
取检样100g（或100mL)入已预热至44℃装有900mL缓冲蛋白陈水的锥形瓶中，用手缓缓地摇动至充分溶解，36℃+1℃培养18h士2h。移取1mL转种于10mLmLST-Vm肉汤、44℃±0.5℃培养24h士2h.
5.2分离
5.2.1轻轻混勾mLST-Vtm肉汤培养物，各取增菌培养物1环，分别划线接种丁两个DFI平板，36℃±1 ℃培养 24 h+2 h。
5.2.2挑瑕1个~5个可疑菌蒋(直径约1mm～~3mm的蓝绿色菌落）,划线接种于TSA平板。25℃+1℃培养48h±1h。
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5.3鉴定
GB/T 4789.40-2008
自TSA平板上点接挑取黄色可疑荫落，进行生化鉴定，阪崎肠杆菌的主要生化特征见表1。可选择API20E生化鉴定试剂盒或VITEK全自动微牛物鉴定系统等生化鉴定系统。表1崎肠杆菌的主要生化特征
生化试验
黄色素产生
氧化酶
1.赖氨酸脱羧酶
1-乌氨酸脱羧酶
1-精氨酸双水解醇
柠檬酸水解
D山梨醇
L-鼠亦糖
D-麓糖
D-蜜.糖
苦杏仁成
注：“+”>99%阳性;“\>99%荫性;\(+)\90%～99%阳性;“(—)\90%~99%阴性5.4阪崎肠杆菌的报告
综合菌落形态利生化特征，报告征100g（或100mL)样品中检出或未检出阪崎肠杆菌。第二法
阪崎肠杆菌的计数
6操作步骤
6.1样品的稀释
6.1.1固体和半固体样品：无菌称取样品 100 g、10 名、1名各三份,加人已预热至 44 ℃分别盛有900 rmL、90 mL、9 mL BPW 中,轻轻振摇使充分济解,制成 1 ：10 样品匀液,置 36 ℃士1 ℃培养 18 h士2h。分别移取1mL转种于10mLmLST-Vm肉汤，44℃±0.5℃培养24h±2h.6.1.2液体样品:以无菌吸管分别取样品 100 mL、10 mL,1 mL各三份,加入已预热至 44 ℃分别盛有900 tuL.,90 mL、9 mT, PW 中,轻轻振摇使充分混匀,制成 1：10 样品液,置 36 ℃±1 ℃培养 18 h上2 h。分别移取 1 mL转科于 10 mL mLST-Vm 肉涵,44 ℃±0.5 ℃培养 24 h士2 h。6.2分离、鉴定
同 5. 2 ~ 5. 3。
6. 3阪崎肠杆菌计数的报告
综合菌落形态、生化特征，根据证实为阪崎肠杆菌的阳性管数，查 MPN检索表，报告每 100 g（或100 mL)样品中阪畸肠杆菌的MPN值(见表B.1)。品球体网
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A.1缓冲蛋白陈水(BPW)
A.1.1成分
蛋白陈
飘化钠
磷酸氢二钠(Na2HPO,·12H,O)
磷酸一氢钾
蒸馏水
A, 1. 2制法
附录A
(规范性附录）
培养基和试剂
1000 mL
加热搅拌至溶解.调节 pH,121 ℃高压火菌 15 min。A.2改良月桂基硫酸盐胰蛋白陈肉汤-万古霉素(madified lauryl sulfate tryptose brotlr-vancomycin ine-dium,mIST-Vm)
A. 2. 1效良月桂基硫酸盐胰蛋白陈(mL.ST)肉汤A.2. 1. 1成分
氯化钠
胰蛋白陈
磷酸二氢钾
磷酸氢二钾
十二烷基硫酸钠
蒸馏水
pH 6. 8±0.2
A. 2. 1. 2制法
1 000 mL
加热搅拌至溶解，调节pH。分装每管10tL，121℃高压火菌15min。A,2.2万古霉素溶液
A.2.2. 1成分
万古筹素
蒸馏水
A2.2.2制法
10.0 mg万占霉素溶解10.0ml蒸馏水,过滤除菌。方古密素溶液可以在0℃～5℃保存15天。A.2.3改良月桂基硫酸盐胰蛋白陈肉汤-万古霉素（modifiedlauryl sulfatetryptosebroth-vancomycinmedium, miST-Vm)
每1UmmI.ST加人方占露素溶液0.1mI.,混合液中万霉素的终浓度为10μg/mL。注意：tLST-Vm必须在241 h之内使用4
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A.3阪崎肠杆菌显色培养基(DFI琼脂）A.3.1成分
胰蛋白陈
大豆蛋白
氯化钠
柠檬酸铁铵
硫代硫酸钠
脱氧胆酸钠
5-漠-4-氯-3-吲哚-α-D-吡哺葡糖试琼脂
蒸馏水
pH 7. 3 +0. 2
A3.2制法
1000 mL
加热搅拌至完全溶解，谢节pH,121 ℃高压15min,冷却至5i0 ℃,倾注-板。A, 4 胰蛋白陈大豆琼脂(TSA)
A.4.1成分
胰蛋白陈
植物蛋白
氯化钠
蒸馏水
pH 7. 3±0. 2
A.4.2制法
1 000 mt.
加热搅拌牟溶解，煮沸 1 min,调节 pH,12l ℃高压 15 min。A.5氧化酶试剂
A.5.1成分
N,N.N\,N\-四中基对苯二胺盐酸盐蒸馏水
A.5.2制法
少量新鲜配制，于冰箱内避光保存，在7d之内使用。A.5.3试验方法
100, 0 mL
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用玻离棒或一次性接种针挑取单个特征性菌落，涂布在氧化酶试剂湿润的滤纸平板上。如果滤纸在10之内术变为紫红色、紫色或深蓝色，则为氧化酶试验阴性，否则即为氧化酶实验阳性。注意：实验中切勿使用镍/铬材料。A,6L-赖氨酸脱羧酶培养基
A.6.1成分
L-赖氨酸盐酸盐（L-lysinemonohydrochloridc）酵母浸膏
葡菊糖
http:
ate net
GB/T 4789.40—2008
溴甲酚紫
蒸馏水
A. 6. 2 制法
1 000 ml.
将各成分加热溶解，必要时调节pH,使之在火菌后25℃pH值为6.8二0.2。每管分装5ml.,121℃高压15min。
A.6.3实验方法
挑取培养物接种丁I-赖氮酸脱羧酶培养基，刚好在液体培养基的液面下，30℃二1C培养24十2 h,观察结果。L-赖氮酸脱羧酶试验阳性者,培养基呈紫色,阴性者为黄色。A.7L-鸟氨酸脱羧酶培养基
A.7.1成分
L-鸟氨酸盐酸盐（L-ornithinemonohydrochloride)酵母浸膏
葡萄糖
漠甲酚紫
燕馏水
A.7.2 制法
1 000 mL
将各成分加热溶解，必要时调节 pH,使之在火菌后 25CpH值为 6.810.2。每管分 5 mL。121℃商压15 min。
A.7.3实验方法
挑取培养物接种于 L-鸟氮酸脱羧酶培养基,刚好在液体培养基的液面下，30℃二1 °℃培养 21 h土2h，观察结果，工鸟氨酸脱羧酶试验阳性者,培养基呈紫色，阴性者为黄色。A,8L-精氨酸双水解酶培养基
A.8.1成分
L-精氨酸盐酸盐（Largininemonohydrochloride)酵母浸膏
葡萄糖
溴甲酚紫
蒸馏水
A.8.2制法
1 000 ml
将行成分灿t热溶解，必要时调节pH，使之在灭菌后25℃pH值为6.8+0.2。每管分装5mL。121℃高乐15min。
A.8.3实验方法
挑取培养物接种于L-精氨酸脱羧酶培养基，刚好在液体培养基的液面下。30℃士1℃培养24h上2h,观察结果。-精氨酸脱羧酶试验阳性者，培养基呈紫色，阴性者为黄色。A.9糖类发酵培养基
A,9.1基础培养基
A,9.1.1成分
酪蛋白(酶消化）
氯化钠
蒸馏水
A,9.1.2制法
GB/T4789.40--2008
将各成分加热溶解，必要时调节PH，使之在灭菌后25℃pH值为6.8。每管分装5ml，121℃高压15min.
A.9.2糖类溶液(D-山梨醇、L-鼠李糖、D-蒸糖,D-密二糖、苦杏仁武）A.9.2.1成分
蒸馏水
A.9.2.2制法
分别称取D-山梨醇、L鼠李糖、D-燕糖、D-蜜二糖，告杏仁戒等糖类成分各8g，溶于100mL蒸馏水中，过滤除菌，制成80 mg/mL的糖类溶液。A.9.3完全培养基
A.9.3.1成分
基础培养基
糖类溶液
A, 9. 3. 2 制法
无菌操作，将每种糖类溶液加人基础培养基，混勾;分装到无菌试管中，每管10 mL。A9.4实验方法
挑取培养物接种于各种糖类发酵培养基，刚好在液体培养基的液面下。30℃1℃培养21h土2h,观察结果。糖类发酵试验阳性者，培养基呈黄色，阴性者为红色。A.10西蒙氏柠檬酸盐培养基
A.10.1成分
柠檬酸钠
氯氮化钠
磷酸氢二钾
磷酸二氢铵
硫酸镁
溴百里香酚蓝
蒸馏水
A.10.2制法
8. 0 g~-18. 0 g
1000 mL
将各成分加热溶解，必要时调节pH,使之在火菌后25℃pH值为6.8上0.2。每管分装10ml.，121℃高压15min,制成斜面。
A10.3实验方法
挑取培养物接种于整个培养基斜而，36℃上1℃培养24h士2h，观察结果。阳性者培养基变为蓝色。
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附录B
（规范性附录）
崎肠杆菌最可能数（MPN)检索表每100g(或100mL)检样中阪崎肠杆菌最可能数(MPN)的检索见表B.1。表B.1腋崎肠杆菌最可能数(MPN)检索表阳性管数
95%可信限
阳性背数
95%可信限
注 1:本表采用 3 个检样量L100 g(或 100 mL),10 g(或 10 mL)和 1 g(或 1 mL)],每个检样量接种 3 管上限
注 2:表内所列检样量如改用 1 000 g(或 1 000 mL),10 g(或 10 mL)和 1 g(或 1 mL)刑,表内数字应相应降低10倍：如改用10g（或10mL）,1g（或1mL)和0.1g（或0.1mL.)时，则表内数字应相应增高10倍，其余类摊。
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