【国家标准(GB)】 食品卫生微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验

ICS 07. 100. 30
中华人民共和国国家标准
GB/T 4789.30--2008
代替G3/T4789.30--2003
食品卫生微生物学检验
单核细胞增生李斯特氏菌检验
Microbiological examination of food hygieneExamination of Listeria monocytogenes2008-11-21发布
中华人民共和国卫生部
中国国家标准化管理委员会
2009-03-01实施
GB/T4789.30—2008
本标准的第法修改采用美国FDA&细菌性检验于册》（Bacteriologicalanalyticalmanual,Chaptcr10，2002)第二法等同来用国际分析家学会的《单核细胞增生李斯特氏菌检验方法》（A0AC-R1Pcr-Formance tested mcthadsVIDASListeriamonocytogenesTest,999.06)，第三法等同采用国际分析家学会的《单核细胞增生李斯特氏菌检验方法》（AOACInternationalOfficitlMethod2003.12，BAXListe-ria monocytogenes).
本标准的第-法与美国FDA/BAM方法相比主要区别如下：增菌培养基以LB肉汤替代BLEB肉汤选择性分离培养基以PALCAM代替了OXA，增加了CHROMagarListeria显色培养基；增加了初筛步骤；
培养温度以36℃土1℃代替35℃。本标准代替GB/T4789.302003《食品卫生微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验》。本标准与GB/T4789.30—2003相比主要修改如下：删除了规范性引用文件。
修改第一法。包括选择性分离培养基以PALCAM代替了MMA，增加了CHROMagarListeria显色培养基；增加了初筛步骤；删除了尿素酶试验剂硝酸盘还原试验。增加了第二法，全自动酶联荧光免疫分析仪筛选法。增加了第三法，全自动病原菌检测系统筛选法。本标准的附录 A为规范性附录。本标准山中华人民共和国卫生部提山并归口。本标准由中华人民共和国卫生部负责解释。本标准负贡起草单位：中国疾病预防控制中心营养与食品安全所。本标准参加起草单位：福建省疾病预防控制中心、陕西省疾病预防控制中心、湖北省疾病预防控制中心。
本标摊主要起草人：刘秀梅、杨洋、陈伟伟、郭云昌、田静、马国柱、马弋。本标准所代替标准的历年版本发布情况为：GB/T 4789.30—1994,GB/T 4785.30—2003.科
1范围
食品卫生微生物学检验
单核细胞增生李斯特氏菌检验
GB/T 4789.30—2008
本标准规定了食品中单核细胞增生李斯特氏菌（Listeriamonarytngemes）的检验方法，本标准适用于食品和食源性疾病样品中单核细胞增生李斯特氏菌的检验。2设备和材料
除微生物实验室常规无菌及培养设备外，其他设备和材料如下：2. 1 冰箱:2 ℃-5 ℃。
2.2恒温培养箱：30℃11℃、36℃士1℃。2.3均质器。
显微镜：10×~100×。
电子天平：感量0.1客。
锥形瓶：100mL、500ml。
无菌吸管：1mL（具0.01ml.刻度）、10mL（具0.1ml.刻度）。2.8
无菌平Ⅲ：直径90mm。
无菌试管：16m×160mml。
离心管：30mm×100mm。
无菌注射器：1 ml。
金黄色葡萄球菌（ATCC25923）。马红球菌（Rhordococeusequi）。2. 14 小白鼠:16 g18 g。
2.15全自动微生物鉴定系统(VITEK)\)。2、. 16
全自动酶联荧光免疫分析仪（miniVIDAS或VIDAS)\)全自动病原菌检测系统(BAX系统，包含BAX系统Q7)。3培养基和试剂
含0.6%醇母浸膏的胰酪陈大豆肉汤(TSB-YE)见第A.1章。3.1
3.2含0.6%酵母浸湾的胰酪陈大豆琼脂（TSA-YE)：见第A.2章。3. 3 李氏增菌肉物 LB(LBt,LB);见第 A. 3 章。3.41%盐酸吖啶黄(acriflavinc HCl)溶液：见 A. 3.2. 1.3.51%萘啶酮酸钠盐（naladixicacid)溶液：见A,3.2.1。3.6PALCAM琼脂:见第A.4章。
3.7革兰氏染色液：见第A,5章。1）由法国生物梅里埃公司提供的产品的商品名。给出这一信息是为了方便本标准的便用者,并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效的产品。由英国杜邦公间提供的产品的商品名。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。2
如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效的产品。1
食品伴网ht
GB/T 4789.30—2008
SIM动力培养基：见第A.6章。
3.9缓冲葡萄糖蛋白豚水[中基红(MR)和V-P试验用]：见第A.7章。3.105%~8%羊血琼脂：见第A.8章。糖发酵管;见第 A.9章。
过氧化氢酶试验：见第A.10章。3.12
科玛嘉李斯特氏菌最色琼脂”。3.14APItisteria10300生化鉴定试剂盒或VITEK-GPI鉴定-片l常规培养方法
第一法
4检验程序
单核细胞增生李斯特氏菌检验程序见图1。捡样
25g(或25nL)样品+LBr增菌液225mL，均质30 ℃±1 , 24 h
0.1 mL+10 ml LB:增菌液
30 ±1 ℃, 18 h~24 h
科玛鼎李斯特荫显色培养基
PALCAM琼脂
36 C±1 C, 24 h~48 h
接种木糖、鼠李糖，36 ±1 ，24 b；同时于TSA-YI板划线纯化，30C±1，24b~48h木糖：鼠李糖
结果报告
图1单核细胞增生李斯特氏菌检验程序5操作步骤
5.1增菌
以无菌操作取样品 25 g(或25 mL)加入到含有 225 mL LB增菌液的均质袋中,在拍击式均质器上连续均质lmin～~2min;或放人感有225 mLLB，增菌液的均质杯中,8000 r/rmin~10000 r/min均质 1 min～2 min， 于 30 ℃±1 ℃培养 24 h,移聆 0. mL,转种于 10 mL LB, 增菌液内,于 30 ℃±1 ℃3）出法国科玛嘉公司提供的产品的商品名。给出这一信总是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效的产品。http:
培养18h~24h。
5.2分离
CB/T 4789.30—2008
取LB.二次增菌液划线接种于PALCAM琼脂乎板和科玛嘉李斯特氏菌显色琼脂平板上，于36C士1℃培养24i~~48h,观察各个板1牛长的菌落。典型菌落在科玛嘉李斯特氏菌显色琼脂平板上为小的圆形蓝色菌落，周围有白色晕圈；在PALCAM琼脂平板上为小的圆形灰缘色菌落，周围有棕黑色水解圈，有些菌落有黑色陷。
5.3初筛
白选择性琼脂平板上分别挑取5个以上典型或可疑菌落，分别接种在木糖、鼠李糖发酵管，于36℃工1℃培养24h；同时在TSA-YE平板上划线纯化，于30℃士1℃培养24h～48h。选择木糖阴性、鼠李糖阳性的纯培养物继续进行鉴定。5.4鉴定
5.4.1染色镜检：李斯特氏菌为革兰氏阳性短杆菌，大小为（0.1μm~0.5μm)×(0.5μm2.0m)；用生理盐水制成菌悬液，在油镜或相差显微镜下观察，该菌出现轻微旋转或翻滚样的运动。5.4.2动力试验：李斯特氏菌有动力，呈伞状生长或月牙状生长。5.4.3生化鉴定：挑取纯培养的单个可疑菌落，进行过氧化氨酶试验，过氧化氢酶阳性反应的菌落继续进行糖发酵试验和MR-VP试验。单核细胞增生李斯特氏菌的主要生化特征见表1。裘1单核细胞增生李斯特氏菌生化特征与其他李斯特氏菌的区别凿种
单核细胞增尘李斯特氏菌
(I..monacytogenes)
格氏李斯特氏菌
(L.grayi)
斯氏李斯特氏菌
(l.. seeligeri)
威氏李斯特氏菌
(L, weishimeri)
伊氏李斯特氏菌
(L, ivanovi)
英诺克李斯特氏菌
(L. innucua)
济血反应！葡萄糖bzxZ.net
注：+阳性；一阴性;V反应不定。+
去芽糖
甘解醇
鼠李糖
七叶蓉
5.4.4溶血试验：将羊血琼脂平板底面划分为20个～25个小格，挑取纯培养的单个可疑菌落刺种到而平板上，每格刺种一个菌落，并刺种阳性对照菌（单核细胞增生李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌)和性对照菌(英诺克李斯特氏菌),穿时尽量接近底部,但不要触到底面,同时避免琼脂破裂,36 ℃上1℃增养24h48H，于明毫处观察，单核细胞增生季斯特氏菌和斯氏季斯特氏菌在刺种点周围产生狭小的透明血环,英诺克李斯特氏菌无血环，伊氏李斯特氏菌产生大的透明溶血环，5.4.5协同溶血试验（cAMP)：在羊血琼脂平板上平行划线接种金黄色葡葡球菌和马红球菌，挑取纯培养的单个可疑菌落垂直划线接种于平行线之间，垂直线两端不要触及平行线，于30℃士1‘℃培养24 h～18 h。单核细脑增生李斯特氏菌在靠近金黄色葡萄球菌的接种端溶血增强,斯氏李斯特氏菌的3
全品成伴网ht：
GB/T 4789,30--2008
溶血也增强，而伊氏李斯特氏菌在靠近马红球菌的接种端溶血增强。5.5生化鉴定系统
可选择APTListeria10300生化鉴定试剂盒或V1TEK全自动微生物鉴定系统等生化鉴定系统对5.3中3个～5个纯培养的可疑菌蒋进行鉴定。5.6小鼠毒力试验(可选择）
将符合上述特性的纯培养物接种丁TSB·YE中，于30℃+1℃培养24h，40001/min离心5min，弃上清液，用无菌生理盐水制备成浓度为101CFL/ml.的菌悬液，取此菌悬液进行小鼠腹腔注射3只～5只，每只0.5ml.，观察小鼠死亡情况。致病株于2d~5d内死亡。试验时可用已知菌做对照。单核细胞增牛李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌对小鼠有致病性。5,7结果报告
综合以上生化试验和溶血试验的结果，报告25g（或25mL)样品中检出或米检出单核细脑增生李斯特氏菌，
第二法全自动酶联荧光免疫分析仪筛选法6原理
miniVIDAS或VIDAS单核细胞增生李斯特氏菌分析，是在自动VIDAS仪器上进行的双抗体来心酶联荧光免疫分析为法。固相容器(SPR)用抗单核细胞增生李斯特氏菌抗体包被，各种试剂均封闭在试刻条内。沸过的增菌肉逐入试茶孔后，在特定时闻肉样本中的单核细胸增牛季斯特民菌抗原与包被在SPR内部的单核细跑增生李斯民菌抗体结合，末结合的其他成分通过洗涤步骤除，标记有碱性磷酸酶的抗体与固定在SP尺壁上的单核细跑增生李斯特既菌抗原结合，最后洗去末结合的抗体标记物。SPR中所用荧光物划霹酸4-甲基伞型物，结在SPR壁上的嗨将催化底物转变成具有炭光的产物：4甲基伞形酮，VIDAS光扫描器在波长450nm处检测该荧光强度。试验完成后由VIDAS自动分析结果，得出检测值，并打印出每份样本的检测结果。设备和材料
mini VIDAS 或 VIDAS.
8试剂
8. 1 LMO2 试剂条。
8.2校正液：纯化灭活的单核细胞增生李斯特氏菌抗原标溶液。8.3阳性对照。
8. 4 阴性对照。
8.5 MLE卡。
9操作步骤
9.1前增菌
以无菌操作取样品25g(或25mL)加人到含有225ml.Dcmi-Fraser肉汤的均质袋中.在拍击式均质器上连续均质1min～2mini或放人盛有225ml.Derti-Fraser肉汤的均质杯中，8000 /min~10000r/min均质1min～2min。于30℃+1℃培养24h。[间同时做阳性及阴性对照。9.2增菌与处理
取1mL前增菌液接种于10mLFrascr肉汤，于30℃士1℃培养24h，取1mL增菌液加人试管中,100℃水浴15min。剩余增菌液保存于2℃~5℃，以备对阳性检测结果进行确认，4
h
9.3上机操作
9.3.1输入MLE卡信息
GB/T 4789.30—2008
个试剂盒在使用之前，首先要用试剂盆中的MLE卡间仪器输人试剂规格（或曲线数据）。每盒试剂只带输人一次。
9.3.2校正
在输人MLE卡信息后，使用试剂盒内的校正液进行校正，校正必须做双份测试。以后每14天进行一次校正。
9.3.3检测
取出试剂条，待恢复至室温后进行样本编号。建立work list，输样本编号。
分别吸取500μL对照和样本（冷却至室温）加入到试剂条样本孔中央。依屏幕提示，将试剂条放人仪器相应的位置，
所有分析过程均由仪器自动完成，检测约需15min。9.4结果报告
9.4.1检测值(X)尼样品的相对荧光值(RFV,)与标准溶液的相对荧光值（RFV.)的比值，见式(1)。X
若检测值<0.05,则检测结果为阴性，检测值20.05,则检测结果为阳性。+1
9.4.2检测结果阴性，可直接报告25g（或25mL)样品中米检出单核细胞增生李斯特氏菌。检测结果阳性的样品，应按照5.2～5.4对保存于2℃～5℃的增菌液进行确认并报告。第三法全自动病原菌检测系统筛选法10原理
BAX系统或BAX系统Q7利用多桑酶链反应（PCR）来扩增并检测细菌DNA中特异片段米判断日标菌是否存在。反应所需的引物、DNA聚合酶和核节酸等被合并成为一-个稳定、干燥的片剂，并装人PCR管中，检测系统运用荧光检测来分析PCR产物。每个PCR试剂片都包含有荧光染料，该染料能结合双链DNA，并且受光激发后发出荧光信号。在检测过程中，BAX系统通过测量荧光信号的变化：分析测量数据，从而判定阳性或阴性结果。11设备和材料
11.1系统主机及工作站。
11.2加热槽。
11.3冷却槽。
12试剂
12.1BAX单核细胞增生李斯特氏菌检测试剂盒12.1.1裂解缓冲液。
12. 1.2蛋向酶，
12. 1. 3带药片的 PCR 管。
12. 1, 4透明盖。
12.2溶菌试剂
见第A.11章。
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12.3李斯特氏菌缓冲增菌肉汤（hufferedListeria enrichmentbroth，Bl.FB）见第 A.12 章。
12.4丙磺酸钠-李斯特氏菌缓冲增菌肉汤（MOPS-bufferedListeriaeurichmentbruth，MOPS-RTEB）见第 A. 13 章。
12.5半量FRASEK肉汤(demi-Fraser)见第 A.14章，
12.6UVM李斯特氏菌增菌肉汤（UVM Listeria Enrichment Broth,UVM-LEB）见 A. 15 章。
12,7李斯特氏菌增菌肉汤（Listeria enrichment broth,LEB）见第 A.16 章，
13操作步骤
13.1增菌
13.1.1生肉：称取25g样品于225mLdemi-Friser肉汤巾，均质后，30℃±1℃培养22h～24h；移取100μL转种于 9.9mLMOPS-BLEB中,36C±1℃培养18 h~24 h。13.1.2熟肉制品：称取25g样品于225mL.IVM-LEB中，均质后，30℃七1℃培养22h～24h；移取100 μL转种于 9. 9 mI. MOPS-BLEB 中,36℃±1 ℃培养 18 h~24 h.13.1.3乳品：称取25多样品于225mLLEB中，均质后，在36C士1C培养22h~26h，移取1mL转种于9mLMOPSBLEB中，36℃±1℃培养18h~24h，13.1.4熏鱼：称取25g样品于225mL1.B中,均质后，36℃11℃培养22h26h;移取1mL转科于 9 mL MOPS-BIEB 中,36 ℃±1 ℃培养 18 h-~24 h。13.1.5其他食品：称取25g（或25mL）样品于225mI不含抗生素的BLEB中，均质后，在30℃C士1C培养4h，然后加入抗生素在30℃C士1℃培养20h,移取100μL转种于9.9mLMO0PS-BLEB中，36 ℃±1 ℃培养 18 h~24 h。
13.2上机操作
13.2.1打开加热槽分别加热至55℃和95℃，检查冷藏过夜的冷却槽（4℃）,开机并启动RAX系统软件。姐果仪器自检后建议校正，按屏幕提示进行校正操作。13.2.2创建\rack”文件：根据提示在完整的\rack\文件和“个样”资料中输人样品信息。13,2.3溶菌操作：在每个溶菌管加人200μI.配制好的溶菌试剂,取5μL增菌肉汤加人相应的溶菌管中，盖上盖子。将溶菌管放在55℃加热槽中，加热60min；再将溶菌管转移到在95℃的加热槽中，加热10min;最后将菌管转移到冷却槽.I:（冷却槽从冰箱取出后30min内使用完毕）,冷却5min。剩余增菌肉汤保存丁 2℃~8 ℃,以备对阳性检测结果确认。13.2.4加热循环仪/检测仪：从菜单中选择\RUNFULLPROCESS”加热到设定温度（加热槽90C，盖子100 ℃），
13.2.5溶菌产物转移：将PCR管支架放到专用冷却槽上，然后将带药片的PCR管放人到支架内。将所有的管盖放松并除去一排管盖。用多道加样器将50μL溶菌产物加入此排管中，并用替代的透明盖密封PCR管。唤用新吸头，重复述操作，直至将所右样品转人带药片的PCR管中，13.2.6扩增和检测：按“PCRWizard\的屏幕提示，将加完样的PCR管放入PCR仪/检测仪中开始扩增。全过程(扩增和检测)需要大约3.5 h。当检测完成后，\PCR Wizard\提示取出样品，并自动显示结果。
13.3结果报告
绿色“一\表示阴性结果。
红色“十”表示阳性结果。
黄色“”表示不确定结果。
黄色“”表示错误结果。
13.3.1不确定或错误结果,对保存于2℃~~5℃的增菌液重新上机检测。GB/T4789.30—-2008
13.3.2检测结果阴性，直接报告25g（或25mL)样品中未检出单核细胞增生李斯特氏菌。13.3.3检测结果阳性的样品，应按照5.2-~5.1对保存于2℃～5℃的增菌液进行确认并报告。http://foodmate.netGB/T4789.30—2008
附录A
（规范性附录）
培养基和试剂
A.1含D.6%醇母浸膏的胰酪陈大豆肉汤(TSB-YE）A.1.1成分
多价陈
酵母膏
氯化钠
磷酸氢一钾
葡萄糖
蒸馏水
A. 1,2制法
1 000 mL
将.上述各成分加热搅拌溶解,调pH至7.2~~7.4,分装,121 ℃高压火菌 15min，备用，A,2含 0,6%醇母膏的胰酪陈大豆琼脂(TSA-YE)A.2.1成分
多价膝
氯化钠
磷酸氢二钾
蒸馏水
A.2.2制法
1000 mL
将 1:述各成分加热搅拌溶解,调 pH至 7.2～7.4,分装,121 C高压灭菌 15 min,备用A.3李氏增菌肉汤(LBi,LB2）
A.3.1成分
酵母膏
氯化钠
磷酸二氢钾
磷酸氢二钠
蒸馏水
A,3. 2制法
1 000 mL
将上述成分加热溶解，调pH至7.2~～7.4，分装，121℃高压灭菌15min，备用。8
合品成伴网httn：/
nfoodmate.net
A.3.2.1李氏I液（LB,)225mL中加入：1%啶酮酸（用0.05tmol/L氨氧化钠溶液配制）1%吖啶黄（用无菌蒸馏水配制）A,3.2.2李氏Ⅱ液(LR)200 ml.中加人：1%萘啶酮酸
1%吖啶黄
A. 4PALCAM 琼脂
A.4.1成分
酵母膏
葡萄糖
七叶苷
柠檬酸铁铵
甘露醇
氯化锂
酪蛋白酶消化物
心胰酶消化物
玉米淀粉
肉胃酶消化物
氯化钠
蒸馏水
A.4.2制法
1 000 mL
GB/T 4789.30--2008
将上述成分加热溶解，调pH至7.2~7.4，分装.121℃高压灭菌15min，备用。A.4.2. 1PALCAM选择性添加剂
多粘菌素B
盐酸吖啶黄
头孢他啶
无菌蒸馏水
A. 4. 2.2制法
将PALCAM基础培养基溶化后冷却到50℃，加人2nLPAI.CAM选择性添加剂，混勾后倾倒在无菌的平血中，备用。
A.5革兰氏染色液
A.5.1结晶紫染色液
A.5.1.1成分
结晶紫
95%乙醇
1%草酸铵水溶液
A.5. 1. 2制法
将结晶紫完全溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。9
http:/
wunwfoo
GB/T4789.30—2008
A.5.2革兰氏碘液
A.5.2.1成分
碘化钾
蒸馏水
A. 5. 2. 2制法
300.0 ml.
将碘与碘化钾先进行混合，加人蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300ml.。A.5.3沙黄复染液
A.5.3.1成分
95%乙醇
蒸馏水
A. 5.3.2制法
将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馅水稀释。A.5.4染色法
A.5.4.1将纯培养的单个可疑菌落涂片，火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染1min，水洗。A.5.4.2滴加革兰氏碘液，作用1mi，水洗。A.5.4.3滴加95%乙醇脱色，约15s~30s，直至染色液被洗掉，不要过分脱色，水洗。A.5.4.4滴加复染液，复染1min，水洗、待平、镜检。A.6SIM动力培养基
A.6.1成分
多价膝
硫酸铁铵
硫代硫酸钠
蒸馏水
A.6.2制法
1 000 mL
将上述各成分加热混匀，调pH7.2，分装小试管121℃高压灭菌15min，备用，A.6.3试验方法
挑取纯培养的单个可疑菌落穿刺接种到SIM培养基中，于30℃培养24h48h，观察结果。A.7缓冲葡萄糖蛋白陈水(MR和V-P试验用）A.7.1成分
葡葡糖
磷酸氢二钾
蒸馏水
A.7.2制法
1000mL
溶化后校正pH7.0，分装试管，每管1mL，121℃高压灭菌15rnin，备用。10
合品伴网ht
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