【团体标准】 枸杞及其制品中2-O-β-D-葡萄糖基-L-抗坏 血酸（AA-2βG）的测定 高效液相色谱法

ICS 67.160.10 X 62 TB 团体标准 T/ NAIA 049-2021 枸杞及其制品中2-O-β-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸（AA-2βG）的测定 高效液相色谱法 Determination of 2-O-β-D-Glucosyl-L-Ascorbic Acid (AA-2βG) in Lycium barbarum and Its Products - High Performance Liquid Chromatography 2021-05-30 发布 2021-06-01 实施 宁夏化学分析测试协会 发布 前言 本文件按照GB/T 1.1-2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定编写。 本文件由宁夏化学分析测试协会提出并归口。 本文件起草单位：宁夏菲杰特检测有限公司、宁夏早康枸杞股份有限公司、银川伊百盛生物工程有限公司、宁夏华信达生物科技有限公司、宁夏化学分析测试协会。 本文件主要起草人：马磊、张海星、吴秀玲、林桦、贾丽茹、唐亚楠、柳春海、张小飞。 枸杞及其制品中2-O-β-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸（AA-2βG）的测定 高效液相色谱法 1 范围 本文件规定了枸杞、枸杞制品和加工产物中的2-O-β-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸（AA-2βG）含量检测的高效液相色谱方法。本文件适用于枸杞、枸杞制品和加工产物中2-O-β-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸（AA-2βG）含量的测定。 本方法取样量为10 g时，方法检出限为20 mg/kg。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682-2008 分析实验室用水规格和试验方法 3 原理 样品经过超声提取、抽滤及浓缩，过阴离子交换柱分离纯化，收集组分浓缩后，经高效液相色谱法测定，保留时间定性，外标法定量。 4 试剂与材料 4.1 试剂 除另有规定外，所有试剂均为分析纯，水为符合GB/T 6682-2008中规定的一级水。 4.1.1 甲醇（CH₃OH）：色谱纯。 4.1.2 乙醇（C₂H₅OH）：色谱纯。 4.1.3 磷酸（H₃PO₄）：优级纯。 4.1.4 四丁基溴化铵（C₁₆H₃₆BrN）：分析纯。 4.2 试剂配制 4.2.1 乙醇溶液（33%）：量取33 mL乙醇，加水稀释至100 mL，混匀备用。 4.2.2 磷酸溶液（20 mmol/L）：量取1.4 mL磷酸，加水稀释至1000 mL后，混匀，经过滤、超声脱气后备用。 4.2.3 四丁基溴化铵溶液（5 mmol/L）：称取1.61 g四丁基溴化铵，加水溶解后，再用水稀释并定容至1000 mL，经过滤、超声脱气后备用。 4.3 标准品 2-O-β-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸标准品（C₁₂H₁₈O₁₁，CAS号：562043-82-7）：纯度≥99.0%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。 4.4 标准溶液配制 4.4.1 2-O-β-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸标准储备液：称取2-O-β-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸标准品10 mg（精确到0.0001 g），用水溶解稀释，并定容至10 mL容量瓶中，即得1 mg/mL的标准储备液，冷藏保存。 4.4.2 2-O-β-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸标准使用液：分别精密量取1 mg/mL的2-O-β-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸储备液1.0 mL、2.0 mL于50 mL容量瓶中，用水稀释并定容至刻度，分别制成0.02 mg/mL、0.04 mg/mL的2-O-β-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸标准使用液，冷藏保存。 4.5 材料 4.5.1 一次性微孔滤头：0.45 μm，水相。 4.5.2 Dowex 1-X8型强碱性阴离子交换色谱柱，或相当者。 5 仪器和设备 5.1 高效液相色谱仪，配备二极管阵列或紫外检测器。 5.2 分析天平：感量0.001 g和0.0001 g。 5.3 超声波清洗机。 5.4 旋转蒸发仪。 6 试样制备 取混匀的试样进行粉碎后，备用。 7 分析步骤 7.1 试样处理 称取粉碎好的试样10 g（精确到0.001 g），加80 mL 33%乙醇，30 ℃超声提取1 h，静置浸渍48 h，减压浓缩至10 mL，用Dowex 1-X8型强碱性阴离子交换色谱柱进行分离纯化，收集分离组分，浓缩至10 mL容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀。溶液过0.45 μm水系滤头，供高效液相色谱仪进行测定。 7.2 色谱参考条件 7.2.1 色谱柱：C18色谱柱（250 mm × 4.6 mm, 5 μm），反向色谱柱，或具有同等性能的色谱柱。 7.2.2 流动相：20%甲醇 + 20 mmol/L磷酸 + 5 mmol/L四丁基溴化铵 = 20 + 40 + 40，等度洗脱。 7.2.3 流速：0.5 mL/min。 7.2.4 柱温：35 ℃。 7.2.5 进样量：5 μL。 7.2.6 检测器：二极管阵列或紫外，检测波长均为：254 nm。 7.3 测定 7.3.1 标准曲线的制作 分别精密进样2-O-β-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸标准使用液各5 μL，以及2-O-β-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸标准储备液5 μL、10 μL、15 μL，供高效液相色谱仪测定，得到最终浓度分别为0.02 mg/mL、0.04 mg/mL、1.0 mg/mL、2.0 mg/mL、3.0 mg/mL，以峰面积为纵坐标、浓度为横坐标作图，得到标准曲线回归方程。 7.3.2 试样溶液的测定 待测溶液中待测化合物的响应值应在标准曲线线性范围内，浓度超过线性范围的样品则应稀释后重新进行分析。 7.3.3 空白试验 不称取试样，按7.1的步骤做空白试验。 8 结果计算和表述 按式（1）计算试样中2-O-β-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸的含量： X = (V × C × 10⁻³) / m 式中： X —— 试样中2-O-β-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）； V —— 最终定容体积，单位为毫升（mL）； m —— 样品称样量，单位为克（g）； C —— 曲线中查得的2-O-β-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸含量，单位为毫克每毫升（mg/mL）。 计算结果需扣除空白值，测定结果保留两位有效数字。 9 精密度 在重复条件下获得的两次独立测试结果的绝对差值不得超过其算术平均值的10%。 10 附录 色谱图见附录A。