【团体标准】 食品副溶血性弧菌实时荧光核酸恒温扩增

T/CAIA
中国分析测试协会标准
T/CAIA/SH007-2017
食品副溶血性弧菌实时荧光核酸恒温扩增检测（SAT）方法
Real-Time Simultaneous Amplificationand Testing (SAT)method for detecting V.parahaemo/yticusin in foods2017-07-20发布
中国分析测试协会发布
2017-10-01实施
本标准按照GB/T1.1-2009规则起草。前言
本标准由中国分析测试协会标准化委员会提出并归口。T/CAIA/SH007-2017Www.bzxZ.net
本标准起草单位：上海交通大学公共卫生学院、中国科学院上海生命科学研究院、上海仁度生物科技有限公司。
本标准的附录A、附录B为资料性附录，附录C为规范性附录。本标准主要起草人：王慧、邱红玲、储瑞葛、张常娥、于明辉。本标准为首次发布。
1范围
食品副溶血性弧菌实时荧光
核酸恒温扩增检测（SAT）方法
T/CAIA/SH007-2017
本标准规定了食品中副溶血性弧菌（VParahaemolyticus）的SAT检验技术方法。本标准适用于水产品及相关食物中毒样品中副溶血性弧菌的检验。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。GB4789.7食品安全国家标准食品微生物学检验副溶血性弧菌检验GB4789.1食品安全国家标准食品微生物学检验总则GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测GB/T27405实验室质量控制规范食品微生物检测3术语和定义
下列术语和定义适用于本标准
恒温扩增实时荧光检测技术（SimultaneousAmplificationandTesting，SAT）：指RNA恒温扩增实时荧光检测技术。
4SAT原理
在同一温度下，以细菌RNA为起始模板，通过M-MLV反转录酶产生靶标RNA的一个双链DNA，然后利用T7RNA多聚酶以该DNA为模板产生多个（100～1000）RNA拷贝：每个RNA拷贝数再从反转录开始进入下一个扩增循环：同时，带有荧光标记的优化探针和这些RNA拷贝特异结合后，打开3
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茎环结构，从而产生荧光，根据实时荧光信号的出现时间和强度，结合阳性对照和阴性对照即可对检测结果进行判定。
材料和设备
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其它设备如下：实时荧光恒温检测系统。
5.2台式离心机。
5.3恒温培养箱：36℃±1℃。
5.4振荡器。
5.5冰箱（2℃~8C和-20℃或-80℃）。5.6均质器。
5.7电子天平（感量0.1g）。
5.8微量可调移液器及配套无DNA/RNA酶吸头（10μL、100μL、1000μL）。5.9无DNA/RNA酶离心管（0.5mL、1.5mL、2.0mL）5.10水浴槽
恒温混匀仪
制冰机
干热恒温器
分光光度计
比色血
除特别说明外，所用试剂均为分析纯，水为按照GB/T6682规定的一级水。溶解RNA所用的水必须为无RNA酶污染一级水。所用试剂均用无DNA/RNA酶污染的容器分装。3%氯化钠碱性蛋白陈水：见附录A中A.1。6.1
6.2无菌生理盐水：见附录A中A.2。6.3副溶血性弧菌SAT实验相关引物及探针：上游引物：扩增副溶血性弧菌种属特异性基因的转录产物RNA的上游引物（序列见附录B中B.1.1)。下游引物：扩增副溶血性弧菌种属特异性基因的转录产物RNA的下游引物，包含T7启动子识别位点4
（序列见附录B中B.1.1)。
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副溶血性弧菌特异性探针：探针的5'端标记荧光报告基团FAM，3端标记荧光淬灭基团DABCYL（序列见附录B中B.1.1)。
内质控RNA（IC-RNA)，体外转录成RNA，加入到每个反应体系中（序列见附录B中B.1.1)。内质控探针：探针的5\端标记荧光报告基团HEX，3\端标记荧光淬灭基团DABCYL，识别内质控RNA上的特定序列（序列见附录B中B.1.1）6.4阳性质控品：由有资质的权威机构提供副溶血性弧菌标准菌株，-80℃冰箱保存。（来源和编号，见附录B1.1
6.5SAT反应液（成分见附录B.1.1）6.6SAT酶液
（含M-MLV反转录酶、T7RNA多聚酶等成分，见附录B.1.1）6.7Trizol溶液
6.8氯仿
6.9异丙醇
6.10无水乙醇
6.11RNA提取试剂盒
6.12溶菌酶
实验室安全防护
实验室结构和设施、安全操作规程、安全设备及个体防护应符合GB19489中二级生物安全防护实验的要求。
8检测流程