【团体标准】 《化妆品微生物检验方法（定性） ATP生物荧光增幅法》

ICS 71.100.70 Y42 团体标准 T/CAFFCI 46-2021 化妆品微生物检验方法（定性）ATP生物荧光增幅法 Qualitative detection of microorganisms in cosmetics — Amplified ATP bioluminescence method 2021-04-30发布 2021-05-29实施 中国香料香精化妆品工业协会 发布 前言 本标准按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。 本标准由中国香料香精化妆品工业协会提出并归口。 本标准起草单位：中国食品发酵工业研究院有限公司、中国食品药品检定研究院、联合利华（中国）有限公司、广州宝洁有限公司、查士利华微生物应用技术（上海）有限公司、广州浪奇实业股份有限公司、上海创元化学工业有限公司等。 本标准主要起草人：刘艺茹、赖顺果、蔡敏、曾四立、沈颖、林牙、俊松等。 1 范围 本标准规定了化妆品中微生物的检验方法（定性）——ATP生物荧光增幅法的仪器和设备、培养基和试剂、检验步骤和结果判读。 本标准适用于化妆品中微生物的检验。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 本文件没有需要定义的术语和定义。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件： a) ATP：三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate） b) ADP：二磷酸腺苷（Adenosine diphosphate） c) AK：腺苷激酶（Adenylate kinase） d) TAT：胰酪大豆胨液体培养基（Trypticase soy broth） e) MTAT：改良胰酪大豆胨吐温80液体培养基（Modified trypticase soybroth tween 80） 5 检验方法 5.1 方法提要 样品稀释制成检液，经MTAT富集培养后，利用微生物体内的AK，催化外源添加的ADP底物生成ATP，实现ATP增幅；通过添加荧光素酶和荧光素，将ATP高能键在断裂过程中产生的能量转化为生物荧光信号；采用全自动荧光光度仪检测，根据生物荧光信号强度判断样品中是否含有微生物。 5.2 仪器和设备 a) 全自动荧光光度仪：需具备试剂添加、计时、读取荧光强度等功能； b) 摇床培养箱：30℃ ± 2℃，圆周式震荡，200 r/min ~ 250 r/min； c) 轨道式往复式摇床：振幅3.81 cm，280 r/min，或经验证具有同等破壁效果的摇床； d) 生物安全柜； e) 漩涡混合器：0 r/min ~ 2500 r/min； f) 高压灭菌器； g) 电子天平：量程0 g ~ 200 g，精确至0.1 g； h) 移液器：50 μL、100 μL、1 mL、5 mL； i) 玻璃珠； j) 旋盖玻璃瓶； k) 量筒：10 mL； l) 烧杯：20 mL； m) pH计。 5.3 培养基和试剂 5.3.1 通用要求 在没有注明其他要求时，均使用分析纯试剂。试验用水应符合GB/T 6682中规定的三级水。 5.3.2 TAT基础培养基 5.3.2.1 成分 胰蛋白胨 15.0 g 大豆卵磷脂 15.0 g 葡萄糖 2.5 g 氯化钠 5.0 g 吐温80 0.5 g 水 1000 mL 5.3.3 MTAT培养基 5.3.3.1 成分 TAT基础培养基（见5.3.2） 1000 mL 硫代硫酸钠 0.05 g 组氨酸 0.01 g 蛋白胨 2.25 g 葡萄糖 0.75 g 注： 1) 例如Celsis Advance II光度计。给出这一信息是为了方便本文件的使用者，并不表示对该产品的认可，如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效的产品。 2) TAT基础培养基仅用于后续MTAT培养基的配置。 5.3.3.2 制备 先将卵磷脂和吐温80加入水中，加热溶解，再加入其他成分，溶解并混匀。使用6 mol/L NaOH或HCl溶液调pH值至7.0 ± 0.2，121℃高压灭菌15 min。 5.3.4 消泡剂 聚二甲基硅氧烷大颗粒乳液或其他等效产品。 5.3.5 ATP生物荧光检测试剂盒 含细胞裂解剂、荧光素酶/荧光素复合物、AMPiScreen试剂等。 注：AMPiScreen试剂。给出这一信息是为了方便本文件的使用者，并不表示对该产品的认可，如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效的产品。 5.4 操作步骤 5.4.1 通用要求 产品第一次进行试验前，需进行方法验证。试验步骤参见附录（略）。 5.4.2 检液制备 按照《化妆品安全技术规范》规定的方法，制备成1:10稀释的检液。 5.4.3 增菌 取10 mL 1:10稀释的检液加入90 mL MTAT培养基中，混匀。如产品抑菌性较强，可延长培养时间或增加MTAT培养基用量，直至产品抑菌作用消失。将培养基置于摇床培养箱中，30℃ ± 2℃培养18 h ~ 24 h。另取100 mL MTAT培养基作为培养基空白，按相同条件培养。 5.4.4 上机检测 在100 mL增菌后的产品试样中加入15 g玻璃珠和0.1 mL消泡剂，置往复式摇床上280 r/min振荡处理30 min。 取破壁处理后的产品试样50 μL上机检测（见5.2 a)，按照仪器和试剂使用说明书进行操作，完成ATP生物荧光增幅法检测。同时取培养基空白50 μL做两个平行样，以同样方法上机检测。 5.5 结果判读 （原文此处内容缺失，通常依据仪器说明书或标准规定阈值进行判断，若信号值高于背景值一定倍数则判定为阳性。）