【团体标准】 肉类食品中家鸭、番鸭DNA成分检测 实时荧光PCR法

ICS 67.050 X 04 团体标准 T/SATA 011—2019 肉类食品中家鸭、番鸭DNA成分检测 实时荧光PCR法 Real-time PCR Detection Method for Anas platyrhynchos domestica and Cairina moschata DNA Ingredients in Meat Product 2019-03-11 发布 2019-04-11 实施 深圳市分析测试协会 发布 前言 本标准按照GB/T 1.1给出的规则起草。 本标准由深圳市分析测试协会归口。 本标准主要起草单位：深圳市计量质量检测研究院。 本标准主要起草人：林霖、陈国培、吴佳辉、张世伟、王坤、朱成杰、余灏、赖心田、杨国武。 本标准为首次发布。 1 范围 本方法适用于食品中家鸭（Anas platyrhynchos domestica）和番鸭（Cairina moschata）DNA成分的实时荧光PCR检测方法。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 3 原理 使用商业化DNA提取试剂盒，获得适用于实时荧光PCR检测的DNA。分别使用基于12S rRNA基因设计的家鸭、番鸭通用引物以及特异性探针，通过双重实时荧光PCR反应，分别获得Ct值，根据Ct值判断样品是否检出相应的DNA成分。 4 试剂和材料 除另有规定外，本方法中所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T 6682的一级水。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。 4.1 通用引物序列 5'端引物：5'-ACGTACATACCGCCCGTCA-3' 3'端引物：5'-ATTCTAAGTACACCTTCCGGT-3' 4.2 特异性探针序列 家鸭DNA成分探针：5'-FAM-ACATAATTAATACCACGTAAATGCCAA-BHQ1-3' 番鸭DNA成分探针：5'-CY5-ACATAACTAATACCCTAAACATGCCAA-BHQ1-3' 注：荧光标记基团及淬灭基团可根据所使用的仪器设备调整，应选择无交叉信号的两种荧光基团。 4.3 商业化DNA提取试剂盒 4.4 商业化PCR反应预混液 5 仪器和设备 5.1 实时荧光PCR仪 5.2 微量紫外分光光度计 5.3 恒温水浴锅或恒温混匀仪或金属干浴器 5.4 高速冷冻离心机：离心力18,000 g以上 5.5 样品粉碎机 5.6 微量移液器（0.5-10 μL, 10-100 μL, 20-200 μL, 100-1000 μL） 5.7 涡旋振荡器 5.8 天平：感量0.001 g 6 分析步骤 6.1 样品前处理 样品经粉碎破碎处理后进行DNA提取步骤。 6.2 DNA提取 按照商业化DNA提取试剂盒说明书中要求的取样量称取样品，每个样品设置两个平行。若有调味料，应使用灭菌去离子水洗涤后去除上清液，按照商业化DNA提取试剂盒说明书操作。 注：试剂盒信息可参考附录A，或使用其他等效试剂盒。 6.3 DNA浓度测定 取1 μL DNA溶液，使用微量紫外分光光度计按照dsDNA（双链DNA）计算方式检测其浓度。 6.4 实时荧光PCR扩增 实时荧光PCR反应体系见表1。 表1 实时荧光PCR反应体系 PCR预混液（2×）：10 μL 10 μmol/L 上游引物：0.4 μL 10 μmol/L 下游引物：0.4 μL 10 μmol/L 探针（家鸭、番鸭探针混合）：0.2 μL DNA：20-50 ng 灭菌去离子水：补充至总体积20 μL PCR反应程序：95℃ 15 s；95℃ 5 s，60℃ 34 s（读取荧光），共40个循环。 6.5 实验对照 分别设置阳性对照、阴性对照、PCR空白对照、空白提取对照各一个。 以相应物种提取的DNA为阳性对照； 以已知不含相应物种DNA的样品为阴性对照； 以灭菌去离子水替代DNA加入实时荧光PCR反应体系为PCR空白对照； 以灭菌去离子水替代样品进行DNA提取为空白提取对照。 7 结果判断与表述 （注：原文此处截断，根据标准常规逻辑，通常包含Ct值判定规则，如Ct<35且高于阴性对照Ct值等，但依据规则“不要编造原文没有的信息”，此处保留章节标题，后续内容因OCR文本缺失而不展示。） 8 防污染措施 （注：原文此处缺失，仅保留标题结构） 9 方法检出限 （注：原文此处缺失，仅保留标题结构） 附录A（资料性附录） DNA提取试剂盒组成、操作步骤 （注：原文此处缺失具体步骤，仅保留标题结构）