【团体标准】 肉类食品中家鸭、番鸭DNA成分检测 实时荧光PCR法

ICS67.050
团体标准
T/SATA
011—2019
肉类食品中家鸭、番鸭DNA成分检测实时荧光PCR法
Real-timePCRDetctionMethodforAnasplatyrhynchosdomesticaand CairinamoschataDNAIngredientsinMeatProduct
2019-03-11发布
深圳市分析测试协会
2019-04-11实施
规范性引用文件
试剂和材料
仪器和设备
分析步骤，
结果判断与表述
防污染措施
方法检出限
附录A（资料性附录）DNA提取试剂盒组成、操作步骤..T/SATA 011—2019
本标准按照GB/T1.1给出的规则起草。本标准由深圳市分析测试协会归口。前言
本标准主要起草单位：深圳市计量质量检测研究院。T/SATA
011—2019
本标准主要起草人：林霖、陈国培、吴佳辉、张世伟、王坤、朱成杰、余灏、赖心田、杨国武本标准为首次发布。
1范围
食品中家鸭、番鸭DNA成分检测
实时荧光PCR法
T/SATA011—2019
本方法适用于食品中家鸭（Anasplatyrhynchosdomestica）和番鸭（Cairinamoschata）DNA成分的实时荧光PCR检测方法。
规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682
GB/T27403
分析实验室用水规格和试验方法实验室质量控制规范食品分子生物学检测使用商业化DNA提取试剂盒，获得适用于实时荧光PCR检测的DNA。分别使用基于12SrRNA基因设计的家鸭、番鸭通用引物以及特异性探针，通过双重实时荧光PCR反应，分别获得Ct值，根据Ct值判断样品是否检出相应的DNA成分。试剂和材料
除另有规定外，本方法中所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682的一级水。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。
4.1通用引物序列
5端引物：5-ACGTACATACCGCCCGTCA-3，3端引物：5-ATTCTAAGTACACCTTCCGGT-3，4.2特异性探针序列
家鸭DNA成分探针：5-FAM-ACATAATTAATACCACGTAAATGCCAA-BHQ1-3”番鸭DNA成分探针：5-CY5-ACATAACTAATACCCTAAACATGCCAA-BHO1-3注：荧光标记基团及率灭基团可根据所使用的仪器设备调整，应选择无交叉信号的两种荧光基团4.3商业化DNA提取试剂盒。
4.4商业化PCR反应预混液。
仪器和设备
5.1实时荧光PCR仪。
5.2微量紫外分光光度计。
5.3恒温水浴锅或恒温混匀仪或金属干浴器。5.4高速冷冻离心机：离心力18.000g以上。5.5样品粉碎机
T/SATA
011—2019
5.6微量移液器（0.5-10μ，10μ-100μ，20μ-200μ，100μ-1000μ）。5.7涡旋振荡器。
5.8天平：感量0.001g。
分析步骤
6.1样品前处理
样品经粉样破碎处理后进行DNA提取步骤。6.2DNA提取
按照商业化DNA提取试剂盒说明书中要求的取样量称取样品，后每个样品设置两个平行，若有调味料应使用灭菌去离子水洗涤后去除上清液，按照商业化DNA提取试剂盒说明书操作。注：试剂盒信息可参考附录A，或使用其他等效试剂盒。6.3DNA浓度测定
取1μLDNA溶液，使用微量紫外分光光度计按照dsDNA（双链DNA）计算方式检测其浓度。6.4实时荧光PCR扩增
实时荧光PCR反应体系见表1。
表1实时荧光PCR反应体系
PCR预混液（2×）
10μmol/L上游引物
10μmol/L下游引物
10μmol/L探针（家鸭番鸭探针混合）DNA
灭菌去离子水
10 μL
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补充至总体积20μL
95℃5s，60℃34s（读取荧光），40个循环。PCR反应程序：95℃15S：
6.5实验对照
分别设置阳性对照、阴性对照、PCR空白对照、空白提取对照各一个。以相应物种提取的DNA为阳性对照，以已知不含相应物种提取的DNA为阴性对照，以灭菌去离子水替代DNA加入实时荧光PCR反应体系为PCR空白对照，以灭菌去离子水替代样品进行DNA提取为空白提取对照。7
结果判断与表述