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- T/CVMA 13-2018H7N9亚型禽流感病毒双重实时荧光RT-PCR检测方法
标准号：
T/CVMA 13-2018
标准名称：
H7N9亚型禽流感病毒双重实时荧光RT-PCR检测方法
标准类别：
团体标准
英文名称：
Duplex real-time RT-PCR assay for detection of avian influenza A (H7N9) virus标准状态：
现行-
发布日期：
2018-10-24 -
实施日期：
2018-10-24 出版语种：
简体中文下载格式：
.zip.pdf下载大小：
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标准简介：
本标准适用于各级动物疫病预防与控制中心实验室、动物疫病第三方检测机构、动物疫病诊断试剂生产研发企业、兽医相关高校和研究所等机构利用实时荧光RT-PCR方法对H7N9亚型禽流感病毒的检测，以及禽流感病毒HA基因和/或NA基因的检测
标准内容部分标准内容：
ICS11.220
T/CVMA132018
H7N9亚型禽流感病毒双重实时荧光RT-PCR检测方法
Duplexreal-timeRT-PCRassayfordetectionofavianinfluenzaA(H7N9)virus2018-10-24发布
2018-10-24实施
协会发布
本标准按GB/T1.1-2009给出的规则起草。T/CVMA13—2018
本标准由中国兽医协会提出并归口。中国兽医协会
本标准起草单位：中国动物疫病预防控制中心本标准主要起草人：刘玉良、王传彬、宋晓晖、吴佳俊、杨林、孙明、陈西钊、乔明明、蒋菲、顾小雪、刘洋、张硕、韩焘、赵柏林。CVMA
1范围
T/CVMA13—2018
H7N9亚型禽流感病毒双重实时荧光RT-PCR检测方法本标准规定了H7N9亚型禽流感病毒双重实时荧光RT-PCR检测试剂、仪器设备、实验操作步骤。本标准适用于禽组织、分泌物、排泄物和培养物中H7N9亚型禽流感病毒检测。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范3试剂
3.1RNA提取试剂
RNA提取试剂详见附录A.1～A.4，或选取商品化的病毒RNA提取试剂盒。3.25×RT-PCR缓冲液
Trisbase
MgCl26H20
加无核酸酶灭菌蒸馏水至400mL，调pH值至8.3（室温下），定容至500mL。过滤（0.22um）除菌后置于2℃～8℃保存备用。3.3.10×PCR缓冲液的配制
Tris base
TritonX-100
加无核酸酶灭菌蒸馏水至400mL，用HCI调pH值至9.0（室温下），定容至500mL。高压灭菌冷却后置于2℃~8℃保存备用。
3.3引物和探针
HA-7-F
HA-7-R
HA-7-P
NA-9-F
NA-9-R
NA-9-P
所用引物和探针
序列（5°-3'）
TGGTTTAGCTTCGGGGCRTCAT
ACAAATAGTGCACYGCATGTTTCC
FAM-CCATTGYAATGGGYCT-MGB
ACACTCAAACGGAACAATACACG
GACCACCCAATGCATTCCAC
HEX-AAGCTGGCCACTATC-MGB
注1：将表中引物和探针均用无核酸酶灭菌蒸馏水稀释至10pmol/μL后使用。注2：引物序列中，R代表A或G碱基；Y代表C或T碱基3.4其他试剂
T/CVMA13—2018
目的基因
TagDNA聚合酶（5U/uL）、AMV反转录酶（10U/μL）、RNA酶抑制剂（40U/uL）、无水乙醇、无核酸酶灭菌蒸馏水、生理盐水。4仪器设备
分析天平、高速离心机、荧光PCR仪、组织研磨仪、-20℃冰箱、可调移液器。5操作步骤
样品采集
样品采集按照NY/T541进行。对于病死禽，取脑、肺、气管、喉头等组织：对于活禽，用棉拭子轻轻分别采集同一只禽的咽喉分泌物和少量泄殖腔粪便，放在含有保护液（50%甘油生理盐水）的同一离心管中，加盖，编号。
5.2样品处理
5.2.1组织样品Www.bzxZ.net
每份组织分别从三个不同的位置称取样品约1g，剪碎后取适量于研磨器中研磨，加入1.0mL生理盐水继续研磨，待匀浆后转至灭菌离心管中，10,000×g离心2min，取上清液100uL于1.5mL灭菌离心管中。
5.2.2分泌物和排泄物样品
T/CVMA13-—2018
将咽喉/泄殖腔棉拭子在振荡器上充分混合，抢动、挤压干后弃去拭子。10,000×g离心5min，吸取上清100μL于1.5mL灭菌离心管中。5.2.3培养物样品
将培养物10.000×g离心5min，取上清100μL于1.5mL灭菌离心管中。5.3
病毒RNA的提取
若选用附录A中所列试剂提取病毒RNA，则参照以下步骤进行操作：取已处理的样品、阴性对照和阳性对照，分别加入裂解液600、充分颠倒混匀，室温静置3min~5min；
将液体吸入吸附柱中，10,000×g离心30s；弃去收集管中液体，加入600μL洗涤液，10,000×g离心30s：重复上述步骤c）进行洗涤；
弃去收集管中液体，10,000×g离心2min，以除去残留的洗涤液；将吸附柱移入新的1.5mL无菌离心管中，向柱中央加入洗脱液50uL，室温静置1min，10,000×g离心30s，离心管中液体为模板RNA。5.3.2若使用病毒RNA试剂盒提取病毒RNA，则按试剂盒说明书进行操作。5.4双重实时荧光RT-PCR扩增
按照表2配制双重实时荧光RT-PCR扩增反应体系表2
HA引物和探针
NA引物和探针
PCR反应溶液
总体积
双重实时荧光RT-PCR扩增反应体系试剂
HA-7-F
HA-7-R
HA-7-P
NA-7-F
NA-7-R
NA-7-P
无核酸酶灭菌蒸馏水
5×RT-PCR缓冲液
10×PCR缓冲液
AMV反转录酶
RNA酶抑制剂
TaqDNA聚合酶
RNA模板
注：如仅需扩增HA或NA基因，则选择表中扩增该基因的相应引物和探针以及PCR反应溶液配制反应体系，同时增加无菌核酸酶灭菌蒸馏水至6.00μL。3
T/CVMA132018
H7N9亚型禽流感病毒双重实时荧光RT-PCR检测方法
Duplexreal-timeRT-PCRassayfordetectionofavianinfluenzaA(H7N9)virus2018-10-24发布
2018-10-24实施
协会发布
本标准按GB/T1.1-2009给出的规则起草。T/CVMA13—2018
本标准由中国兽医协会提出并归口。中国兽医协会
本标准起草单位：中国动物疫病预防控制中心本标准主要起草人：刘玉良、王传彬、宋晓晖、吴佳俊、杨林、孙明、陈西钊、乔明明、蒋菲、顾小雪、刘洋、张硕、韩焘、赵柏林。CVMA
1范围
T/CVMA13—2018
H7N9亚型禽流感病毒双重实时荧光RT-PCR检测方法本标准规定了H7N9亚型禽流感病毒双重实时荧光RT-PCR检测试剂、仪器设备、实验操作步骤。本标准适用于禽组织、分泌物、排泄物和培养物中H7N9亚型禽流感病毒检测。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范3试剂
3.1RNA提取试剂
RNA提取试剂详见附录A.1～A.4，或选取商品化的病毒RNA提取试剂盒。3.25×RT-PCR缓冲液
Trisbase
MgCl26H20
加无核酸酶灭菌蒸馏水至400mL，调pH值至8.3（室温下），定容至500mL。过滤（0.22um）除菌后置于2℃～8℃保存备用。3.3.10×PCR缓冲液的配制
Tris base
TritonX-100
加无核酸酶灭菌蒸馏水至400mL，用HCI调pH值至9.0（室温下），定容至500mL。高压灭菌冷却后置于2℃~8℃保存备用。
3.3引物和探针
HA-7-F
HA-7-R
HA-7-P
NA-9-F
NA-9-R
NA-9-P
所用引物和探针
序列（5°-3'）
TGGTTTAGCTTCGGGGCRTCAT
ACAAATAGTGCACYGCATGTTTCC
FAM-CCATTGYAATGGGYCT-MGB
ACACTCAAACGGAACAATACACG
GACCACCCAATGCATTCCAC
HEX-AAGCTGGCCACTATC-MGB
注1：将表中引物和探针均用无核酸酶灭菌蒸馏水稀释至10pmol/μL后使用。注2：引物序列中，R代表A或G碱基；Y代表C或T碱基3.4其他试剂
T/CVMA13—2018
目的基因
TagDNA聚合酶（5U/uL）、AMV反转录酶（10U/μL）、RNA酶抑制剂（40U/uL）、无水乙醇、无核酸酶灭菌蒸馏水、生理盐水。4仪器设备
分析天平、高速离心机、荧光PCR仪、组织研磨仪、-20℃冰箱、可调移液器。5操作步骤
样品采集
样品采集按照NY/T541进行。对于病死禽，取脑、肺、气管、喉头等组织：对于活禽，用棉拭子轻轻分别采集同一只禽的咽喉分泌物和少量泄殖腔粪便，放在含有保护液（50%甘油生理盐水）的同一离心管中，加盖，编号。
5.2样品处理
5.2.1组织样品Www.bzxZ.net
每份组织分别从三个不同的位置称取样品约1g，剪碎后取适量于研磨器中研磨，加入1.0mL生理盐水继续研磨，待匀浆后转至灭菌离心管中，10,000×g离心2min，取上清液100uL于1.5mL灭菌离心管中。
5.2.2分泌物和排泄物样品
T/CVMA13-—2018
将咽喉/泄殖腔棉拭子在振荡器上充分混合，抢动、挤压干后弃去拭子。10,000×g离心5min，吸取上清100μL于1.5mL灭菌离心管中。5.2.3培养物样品
将培养物10.000×g离心5min，取上清100μL于1.5mL灭菌离心管中。5.3
病毒RNA的提取
若选用附录A中所列试剂提取病毒RNA，则参照以下步骤进行操作：取已处理的样品、阴性对照和阳性对照，分别加入裂解液600、充分颠倒混匀，室温静置3min~5min；
将液体吸入吸附柱中，10,000×g离心30s；弃去收集管中液体，加入600μL洗涤液，10,000×g离心30s：重复上述步骤c）进行洗涤；
弃去收集管中液体，10,000×g离心2min，以除去残留的洗涤液；将吸附柱移入新的1.5mL无菌离心管中，向柱中央加入洗脱液50uL，室温静置1min，10,000×g离心30s，离心管中液体为模板RNA。5.3.2若使用病毒RNA试剂盒提取病毒RNA，则按试剂盒说明书进行操作。5.4双重实时荧光RT-PCR扩增
按照表2配制双重实时荧光RT-PCR扩增反应体系表2
HA引物和探针
NA引物和探针
PCR反应溶液
总体积
双重实时荧光RT-PCR扩增反应体系试剂
HA-7-F
HA-7-R
HA-7-P
NA-7-F
NA-7-R
NA-7-P
无核酸酶灭菌蒸馏水
5×RT-PCR缓冲液
10×PCR缓冲液
AMV反转录酶
RNA酶抑制剂
TaqDNA聚合酶
RNA模板
注：如仅需扩增HA或NA基因，则选择表中扩增该基因的相应引物和探针以及PCR反应溶液配制反应体系，同时增加无菌核酸酶灭菌蒸馏水至6.00μL。3
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