【团体标准】 H7N9亚型禽流感病毒双重实时荧光RT-PCR检测方法

ICS 11.220 B 41 团 体 标 准 T/CVMA 13—2018 H7N9亚型禽流感病毒双重实时荧光RT-PCR检测方法 Duplex real-time RT-PCR assay for detection of avian influenza A (H7N9) virus 2018-10-24 发布 2018-10-24 实施 中国兽医协会 发布 前言 本标准按GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由中国兽医协会提出并归口。 本标准起草单位：中国动物疫病预防控制中心。 本标准主要起草人：刘玉良、王传彬、宋晓晖、吴佳俊、杨林、孙明、陈西钊、乔明明、蒋菲、顾小雪、刘洋、张硕、韩焘、赵柏林。 1 范围 本标准规定了H7N9亚型禽流感病毒双重实时荧光RT-PCR检测试剂、仪器设备、实验操作步骤。 本标准适用于禽组织、分泌物、排泄物和培养物中H7N9亚型禽流感病毒检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 试剂 3.1 RNA提取试剂 RNA提取试剂详见附录A.1～A.4，或选取商品化的病毒RNA提取试剂盒。 3.2 5×RT-PCR缓冲液 Tris base: 15.14g KCl: 13.98g MgCl2·6H2O: 1.53g DTT: 3.86g 加无核酸酶灭菌蒸馏水至400mL，调pH值至8.3（室温下），定容至500mL。过滤（0.22μm）除菌后置于2℃～8℃保存备用。 3.3 10×PCR缓冲液的配制 Tris base: 6.06g KCl: 18.64g Triton X-100: 5.00mL 加无核酸酶灭菌蒸馏水至400mL，用HCl调pH值至9.0（室温下），定容至500mL。高压灭菌冷却后置于2℃~8℃保存备用。 3.4 引物和探针 表1 所用引物和探针 名称 | 序列（5'-3'） --------------|---------------------------------- HA-7-F | TGGTTTAGCTTCGGGGCRTCAT HA-7-R | ACAATAGTGCACYGCATGTTTCC HA-7-P | FAM-CCATTGYAATGGGYCT-MGB NA-9-F | ACACTCAAACGGAACAATACACG NA-9-R | GACCACCCAATGCATTCCAC NA-9-P | HEX-AAGCTGGCCACTATC-MGB 注1：将表中引物和探针均用无核酸酶灭菌蒸馏水稀释至10μmol/μL后使用。 注2：引物序列中，R代表A或G碱基；Y代表C或T碱基。 3.5 其他试剂 Taq DNA聚合酶（5U/μL）、AMV反转录酶（10U/μL）、RNA酶抑制剂（40U/μL）、无水乙醇、无核酸酶灭菌蒸馏水、生理盐水。 4 仪器设备 分析天平、高速离心机、荧光PCR仪、组织研磨仪、-20℃冰箱、可调移液器。 5 操作步骤 5.1 样品采集 样品采集按照NY/T 541进行。对于病死禽，取脑、肺、气管、喉头等组织；对于活禽，用棉拭子轻轻分别采集同一只禽的咽喉分泌物和少量泄殖腔粪便，放在含有保护液（50%甘油生理盐水）的同一离心管中，加盖，编号。 5.2 样品处理 5.2.1 组织样品 每份组织分别从三个不同的位置称取样品约1g，剪碎后取适量于研磨器中研磨，加入1.0mL生理盐水继续研磨，待匀浆后转至灭菌离心管中，10,000×g离心2min，取上清液100μL于1.5mL灭菌离心管中。 5.2.2 分泌物和排泄物样品 将咽喉/泄殖腔棉拭子在振荡器上充分混合，振荡、挤压干后弃去拭子。10,000×g离心5min，吸取上清100μL于1.5mL灭菌离心管中。 5.2.3 培养物样品 将培养物10,000×g离心5min，取上清100μL于1.5mL灭菌离心管中。 5.3 病毒RNA的提取 5.3.1 若选用附录A中所列试剂提取病毒RNA，则参照以下步骤进行操作： a) 取已处理的样品、阴性对照和阳性对照，分别加入裂解液600μL，充分颠倒混匀，室温静置3min~5min； b) 将液体吸入吸附柱中，10,000×g离心30s； c) 弃去收集管中液体，加入600μL洗涤液，10,000×g离心30s； d) 重复上述步骤c)进行洗涤； e) 弃去收集管中液体，10,000×g离心2min，以除去残留的洗涤液； f) 将吸附柱移入新的1.5mL无菌离心管中，向柱中央加入洗脱液50μL，室温静置1min，10,000×g离心30s，离心管中液体为模板RNA。 5.3.2 若使用病毒RNA试剂盒提取病毒RNA，则按试剂盒说明书进行操作。 5.4 双重实时荧光RT-PCR扩增 按照表2配制双重实时荧光RT-PCR扩增反应体系。 表2 双重实时荧光RT-PCR扩增反应体系 项目 | 体积 (μL) ----------------------|------------ HA-7-F | 0.80 HA-7-R | 0.80 HA-7-P | 0.80 NA-9-F | 0.80 NA-9-R | 0.80 NA-9-P | 0.80 无核酸酶灭菌蒸馏水 | 3.60 5×RT-PCR缓冲液 | 4.00 10×PCR缓冲液 | 2.00 AMV反转录酶 | 0.25 RNA酶抑制剂 | 0.15 Taq DNA聚合酶 | 0.20 RNA模板 | 5.00 总体积 | 20.00 注：如仅需扩增HA或NA基因，则选择表中扩增该基因的相应引物和探针以及PCR反应溶液配制反应体系，同时增加无核酸酶灭菌蒸馏水至6.00μL。