【团体标准】 猪繁殖与呼吸综合征病毒实时荧光RT-PCR检测方法

ICS 11.220 B 41 团体标准 T/CVMA 12-2018 猪繁殖与呼吸综合征病毒实时荧光RT-PCR检测方法 Real-Time RT-PCR for detection of porcine reproductive and respiratory syndrome virus 2018-10-24 发布 中国兽医协会发布 2018-10-24 实施 前言 本标准按 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由中国兽医协会提出并归口。 本标准起草单位：中国动物疫病预防控制中心。 本标准主要起草人：周智、王传彬、杨林、吴佳俊、宋晓晖、翟新验、倪建强、刘玉良、张硕、刘颖肤、赵柏林、顾小雪、曲萍。 1 范围 本标准规定了猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）通用型实时荧光RT-PCR诊断技术、鉴别美洲型和欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒实时荧光RT-PCR诊断技术。本标准主要用于猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)核酸的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 25172 猪常温精液生产与保育技术规范 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 试剂与耗材 3.1 RNA提取试剂 RNA提取试剂详见附录A，或选取商品化的病毒RNA提取试剂盒。 3.2 其他试剂 Taq DNA聚合酶（5U/μL），PrimeScript™ RT Mix II反转录酶混合物，50x ROX Reference Dye II，2x OneStep RT-PCR Buffer III缓冲液，无水乙醇，无菌无核酸酶水，生理盐水。 3.3 引物探针 3.3.1 猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）通用型实时荧光RT-PCR引物和探针，见表1。 表1 猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）通用型实时荧光RT-PCR引物和探针 名称 序列（5'→3'） 美洲型上游引物（NAF） TGGARATTCATCACCTCCAGR 美洲型下游引物（NAR） GTGCCGTTRACCGTAGTGGA 欧洲型上游引物（EUF） ACTTCCAGATGCAGATTGTGT 欧洲型下游引物（EUR） GCCGTTCACTGATGTTAGTCC 探针 FAM-TACATTCTGGCCCCTGCCCAYCA-BHQ 注：将表中引物和探针用无菌无核酸酶水稀释至10 pmol/μL后使用。 3.3.2 美洲型和欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒双重实时荧光RT-PCR引物和探针，见表2。 表2 美洲型和欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒双重实时荧光RT-PCR引物和探针 名称 序列（5'→3'） 美洲型和欧洲型上游引物（NAF-EUF） CGCCAGCCAGTCAATCARC 美洲型和欧洲型下游引物（NAR-EUR） GRGGAAAATGKGGCTTCTCMG 欧洲型探针 FAM-TCCTCCCCTRGGTTGCTGGCGCT-BHQ 美洲型探针 HEX-YCCCGGTCCCTTGCCTCTGGA-BHQ 注：将表中引物和探针用无菌无核酸酶水稀释至10 pmol/μL后使用。 4 仪器与设备 分析天平、高速离心机、荧光PCR仪、组织研磨器、-20℃冰箱、可调移液器。 5 操作步骤 5.1 样品采集 5.1.1 组织样品采集 组织样品采集按照 NY/T 541 进行。取病死猪肺脏、淋巴结、扁桃体等组织；待检活猪，采集血液 3 mL～5 mL，也可采取扁桃体样品。 5.1.2 公猪精液采集 公猪精液采集按照 GB/T 25172 的方法进行。 5.2 样品的处理 5.2.1 组织样品处理 每份组织分别从三个不同的典型病变位置处称取样品约 1 g；剪碎混匀后取 0.02 g 于研磨器中研磨，加入 1.5 mL 生理盐水继续研磨，待匀浆后转至灭菌离心管中，6000 x g 离心 2 min，吸取上清液到新的离心管备用。 5.2.2 血液样品处理 将采集的血液室温或者 37℃ 倾斜放置，待血清析出后吸取上清液到新的离心管备用。 5.2.3 精液样品处理 精液样品无需处理，直接用于核酸提取。 5.2.4 阳性对照样品处理 取美洲型和欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性组织研磨上清液各 100 μL（病毒含量 10^5.0 TCID50/mL），用于病毒RNA提取。 5.2.5 阴性对照样品处理 取猪繁殖与呼吸综合征病毒阴性组织研磨上清液 100 μL，用于病毒RNA提取。 5.3 病毒RNA提取 5.3.1 若选用附录A中所列试剂提取病毒RNA，则参照以下步骤进行操作： a) 取已处理的样品、阴性对照和阳性对照各 100 μL，分别加入裂解液 600 μL，充分颠倒混匀，室温静置 3 min~5 min。 b) 将液体吸入吸附柱中，10000 x g 离心 30 s。弃去收集管中液体，加入 600 μL 洗涤液，10000 x g 离心 30 s。重复步骤 c)。 c) 弃去收集管中液体，10000 x g 离心 2 min，以除去残留的洗涤液。 d) 将吸附柱移入新的离心管中，向柱中央加入洗脱液 50 μL，室温静置 1 min，10000 x g 离心 30 s，离心管中液体即为模板RNA。 5.3.2 若使用病毒RNA试剂盒提取病毒RNA，则按试剂盒说明书进行操作。 5.4 实时荧光RT-PCR扩增方法 5.4.1 按照表3配制猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）通用型实时荧光RT-PCR扩增反应体系。 表3 猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）通用型实时荧光RT-PCR扩增反应体系 试剂 体积 无菌无核酸酶水 4.3 μL 美洲型上游引物（10 pmol/μL） 0.9 μL 美洲型下游引物（10 pmol/μL） 0.9 μL 欧洲型上游引物（10 pmol/μL） 0.9 μL 欧洲型下游引物（10 pmol/μL） 0.9 μL 探针（10 pmol/μL） 0.6 μL 2× OneStep RT-PCR Buffer III 缓冲液 12.5 μL Taq DNA 聚合酶（5 U/μL） 0.5 μL PrimeScript™ RT Enzyme Mix II 0.5 μL 50x ROX Reference Dye II 0.5 μL RNA模板 2.5 μL 总体积 25.0 μL 将表3中所有试剂加入荧光RT-PCR反应管后，充分混匀，做好标记。猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）通用型实时荧光RT-PCR扩增所用荧光报告基团为FAM，淬灭基团为BHQ或None。在荧光PCR仪上按表4所示程序进行扩增反应。 表4 猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）通用型实时荧光RT-PCR扩增程序 步骤 温度 持续时间 循环数 1 42℃ 5 min 1 2 95℃ 10 s 40 3 95℃ 5 s 40 4 60℃ 35 s 40 注：在每个循环第二步（60℃ 35 s）收集荧光信号。 5.4.2 按照表5配制鉴别美洲型和欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒实时荧光RT-PCR扩增反应体系。 表5 鉴别美洲型和欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒实时荧光RT-PCR扩增反应体系 （注：原文在此处截断，未提供表5的具体内容及后续步骤）