【团体标准】 猪繁殖与呼吸综合征病毒实时荧光RT-PCR检测方法

ICS11.220
T/CVMA12-2018
猪繁殖与呼吸综合征病毒实时荧光RT-PCR检测方法
Real-Time RT-PCR for detection of porcine reproductiveandrespiratorysyndromevirus
2018-10-24发布
2018-10-24实施
协会发布
本标准按GB/T1.1-2009给出的规则起草。T/CVMA12—2018
本标准由中国兽医协会提出并归口。中国兽医协会
本标准起草单位：中国动物疫病预防控制中心。本标准主要起草人：周智、王传彬、杨林、吴佳俊、宋晓晖、翟新验、倪建强、刘玉良、张硕、刘颖肤、赵柏林、顾小雪、曲萍。CVMA
1范围
T/CVMA12—2018
猪繁殖与呼吸综合征病毒实时荧光RT-PCR检测方法本标准规定了猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）通用型实时荧光RT-PCR诊断技术、鉴别美洲型和欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒实时荧光RT-PCR诊断技术。本标准主要用于猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)核酸的检测。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T25172猪常温精液生产与保育技术规范兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范执行NY/T541
3试剂与耗材
3.1RNA提取试剂
RNA提取试剂详见附录A，或选取商品化的病毒RNA提取试剂盒。3.2其他试剂
TagDNA聚合酶（5U/uL），PrimeScriptTMRTMixII反转录酶混合物，50xROXReferenceDyeIl，2xOneStepRT-PCRBufferⅢI缓冲液，无水乙醇，无菌无核酸酶水，生理盐水。3.3引物探针
3.3.1猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）通用型实时荧光RT-PCR引物和探针，见表1。表1猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）通用型实时荧光RT-PCR引物和探针序列名称
美洲型上游引物（NAF）
美洲型下游引物（NAR）
欧洲型上游引物（EUF）
欧洲型下游引物（EUR）
序列（5-3）
TGGARATTCATCACCTCCAGR
GTGCCGTTRACCGTAGTGGA
ACTTCCAGATGCAGATTGTGT
GCCGTTCACTGATGTTAGTCC
FAM-TACATTCTGGCCCCTGCCCAYCA-BHQ注：将表中引物和探针用无菌无核酸酶水稀释至10pmo1/μL后使用。3.3.2美洲型和欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒双重实时荧光RT-PCR引物和探针，见表2。表2美洲型和欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒双重实时荧光RT-PCR引物和探针序列名称
美洲型和欧洲型上游引物（NAF-EUF）美洲型和欧洲型下游引物（NAR-EUR）欧洲型探针
美洲型探针
序列（5°-3'）
CGCCAGCCAGTCAATCARC
GRGGAAAATGKGGCTTCTCMG
FAM-TCCTCCCCTRGGTTGCTGGCGCT-BHQHEX-YCCCGGTCCCTTGCCTCTGGA-BHQ注：将表中引物和探针用无核酸酶的灭菌蒸馏水稀释至10 pmo1/μL后使用。4
仪器与设备
分析天平、高速离心机、荧光PCR仪、组织研磨器、-20C冰箱、可调移液器。5操作步骤
5.1样品采集
组织样品采集
T/CVMA12—2018
组织样品采集按照NY/T541进行。取病死猪肺脏、淋巴结、扁桃体等组织；待检活猪，采集血液3mL～5mL，也可采取扁桃体样品。
2公猪精液采集
公猪精液采集按照GB/T25172的方法进行。5.2样品的处理
5.2.1组织样品处理
每份组织分别从三个不同的典型病变位置处称取样品约1g；剪碎混匀后取0.02g于研磨器中研磨，加入1.5mL生理盐水继续研磨，待匀浆后转至灭菌离心管中，6000xg离心2min，吸取上清液到新的离心管备用。
血液样品处理
将采集的血液室温或者37℃倾斜放置，待血清析出后吸取上清液到新的离心管备用。5.2.3精液样品处理
精液样品无需处理，直接用于核酸提取。5.2.4阳性对照样品处理
取美洲型和欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性组织研磨上清液各100uL（病毒含量105.0TCIDso/mL），用于病毒RNA提取。5.2.5阴性对照样品处理
取猪繁殖与呼吸综合征病毒阴性组织研磨上清液100μ，用于病毒RNA提取。5.3病毒RNA提取
若选用附录A中所列试剂提取病毒RNA，则参照以下步骤进行操作：T/CVMA12—2018
取已处理的样品、阴性对照和阳性对照各100uL，分别加入裂解液600μL，充分颠倒混匀，室温静置3min~5min。
将液体吸入吸附柱中，10000×g离心30s。弃去收集管中液体，加入600μ洗涤液，10000g离心30s。重复步骤c)。
弃去收集管中液体，10000xg离心2min，以除去残留的洗涤液。将吸附柱移入新的离心管中，向柱中央加入洗脱液50μL，室温静置1min，10000×g离心30s，离心管中液体即为模板RNA。
若使用病毒RNA试剂盒提取病毒RNA，则按试剂盒说明书进行操作。实时荧光RT-PCR扩增方法
按照表3配制猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）通用型实时荧光RT-PCR扩增反应体系。5.4.1
表3猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）通用型实时荧光RT-PCR扩增反应体系试剂
无菌无核酸酶水
美洲型上游引物（10pmo1/μlL）美洲型下游引物（10pmol/μL）欧洲型上游引物（10pmo1/μL）欧洲型下游引物（10pmo1/μL）探针（10pmo1/μL）
2×OneStepRT-PCRBufferIII缓冲液TaqDNA聚合酶（5uL）此内容来自标准下载网
PrimeScriptTMRTEnzymeMixII
50xROXReferenceDyell
RNA模板
总体积
将表3中所有试剂加入荧光RT-PCR反应管后，充分混匀，做好标记。猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）通用型实时荧光RT-PCR扩增所用荧光报告基团为FAM，淬灭基团为BHQ或None。在荧光PCR仪上按表4所示程序进行扩增反应。
猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）通用型实时荧光RT-PCR扩增程序步骤
注：在每个循环第二步（60℃35s）收集荧光信号。持续时间
循环数
按照表5配制鉴别美洲型和欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒实时荧光RT-PCR扩增反应体系。5.4.2
表5鉴别美洲型和欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒实时荧光RT-PCR扩增反应体系3