【团体标准】 奶及奶制品中乳铁蛋白的测定 液相色谱法

T/TDSTIA 006—2019 奶及奶制品中乳铁蛋白的测定 液相色谱法 Determination of lactoferrin in milk and dairy products - Liquid chromatography method 2019-11-26 发布 2019-12-01 实施 天津市奶业科技创新协会 发布 前言 本标准按照 GB/T 1.1-2009《标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写》给出的规则起草。 本标准的某些内容可能涉及专利。本标准的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由国家奶业科技创新联盟提出，适用于联盟内部实施优质乳工程的企业，其他单位可参考。 本标准起草单位：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，农业农村部奶产品质量安全风险评估实验室（北京），农业农村部奶及奶制品质量监督检验测试中心（北京）。 本标准主要起草人：郑楠，李鹏，张养东，王加启，钟建萍，叶巧燕。 1 范围 本标准规定了奶及奶制品中乳铁蛋白的液相色谱测定方法。 本标准适用于生乳、液态奶和乳粉。 本标准生乳、液态奶的定量限为 5.0 mg/kg；乳粉的定量限为 10.0 mg/kg。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 原理 试样中的乳铁蛋白经磷酸盐缓冲液提取，肝素亲和柱富集净化，用液相色谱仪分析，经反相蛋白质分离柱分离，紫外光检测，外标法定量。 4 试剂或材料 除非另有规定，仅使用分析纯试剂和符合 GB/T 6682 规定的一级水。 4.1 氢氧化钠溶液（10 mol/L）：称取 400.00 g 氢氧化钠，加水溶解，定容至 1 L，混匀。 4.2 三氟乙酸溶液：量取 1 mL 三氟乙酸（色谱纯），用水定容至 1 L，混匀。 4.3 三氟乙酸乙腈溶液：量取 1 mL 三氟乙酸（色谱纯），用乙腈（色谱纯）定容至 1 L，混匀。 4.4 磷酸盐缓冲液 I：称取磷酸氢二钠 23.85 g，磷酸二氢钠 4.99 g，加适量水溶解，用氢氧化钠溶液（4.1）调节 pH 至 7.50，定容至 1 L，混匀。 4.5 磷酸盐缓冲液 II：称取磷酸氢二钠 5.96 g，磷酸二氢钠 0.96 g，氯化钠 5.84 g，加适量水溶解，用氢氧化钠溶液（4.1）调节 pH 至 7.50，定容至 1 L，混匀。 4.6 磷酸盐缓冲液 III：称取磷酸氢二钠 5.96 g，磷酸二氢钠 2.50 g，氯化钠 119.30 g，加适量水溶解，用氢氧化钠溶液（4.1）调节 pH 至 7.50，定容至 1 L，混匀。 4.7 乳铁蛋白对照品：CAS：112163-33-4，纯度 ≥85.0%。 4.8 乳铁蛋白标准储备溶液（10 mg/mL）：将乳铁蛋白对照品按对照品证书提供的纯度换算后称量，用水定容至 10 mL。于 -20℃ 保存，有效期 4 个月。 4.9 乳铁蛋白标准中间溶液（200 mg/L）：准确移取乳铁蛋白标准储备溶液（4.8）200 μL，用水定容至 10 mL。现用现配。 4.10 乳铁蛋白标准系列溶液：准确移取一定量的标准中间溶液（4.9），用磷酸盐缓冲液 I（4.4）稀释定容，配制成乳铁蛋白浓度分别为 0.0 mg/L、20.0 mg/L、40.0 mg/L、60.0 mg/L、80.0 mg/L 和 100.0 mg/L 的标准工作溶液，现用现配。 4.11 肝素亲和柱：HiTrap Heparin HP 柱，1 mL；或其他性能类似的净化柱。 4.12 微孔滤膜：水系，0.22 μm。 5 仪器设备 5.1 高效液相色谱仪：配紫外检测器或二极管阵列检测器。 5.2 天平：感量 0.01 g、0.1 mg。 5.3 容量瓶：5 mL、10 mL、50 mL、1000 mL。 5.4 旋涡混合器。 5.5 离心机：转速不低于 10000 r/min。 5.6 固相萃取装置。 5.7 pH 计：精度为 0.01。 6 样品制备 6.1 生乳、液态奶：取有代表性样品约 200 g，混匀，装入洁净容器作为试样，密封并做好标识，于 0℃～4℃ 冰箱内保存。 6.2 乳粉：取有代表性样品约 200 g，混匀，装入洁净容器作为试样，常温下干燥保存。 7 试验步骤 7.1 提取 7.1.1 生乳、液态奶 称取试样 10 g（精确到 0.01 g），加入磷酸盐缓冲液 I（4.4）定容至 50 mL，混匀，离心 15 min，吸取 25 mL 中间层试液于另一 50 mL 离心管中，离心 15 min。吸取上清液，待净化。 7.1.2 乳粉 称取试样 5 g（精确到 0.01 g），加入磷酸盐缓冲液 I（4.4）混匀，定容至 50 mL，混匀，离心 15 min，吸取 25 mL 中间层试液于另一 50 mL 离心管中，离心 15 min。吸取上清液，待净化。 7.2 净化 肝素亲和柱用 10 mL 磷酸盐缓冲液 II（4.5）活化，准确移取 10 mL 上清液（7.1）过柱，用 10 mL 磷酸盐缓冲液 II（4.5）淋洗，用 4.5 mL 磷酸盐缓冲液 III（4.6）洗脱，收集洗脱液，用磷酸盐缓冲液 III（4.6）定容至 5.0 mL，涡旋混匀，过微孔滤膜后待测。 7.3 测定步骤 7.3.1 液相色谱参考条件 色谱柱：Xbridge Protein BEH C4 柱（柱长 250 mm，柱内径 4.6 mm，填料粒径 3.5 μm），或相当者。 流动相：A：三氟乙酸溶液（4.2），B：三氟乙酸乙腈溶液（4.3）。 检测波长：280 nm。 流速：1.5 mL/min。 柱温：60℃。 进样量：30 μL。 梯度洗脱条件见表 1。 表 1 流动相梯度洗脱条件 时间/min | A/(%) | B/(%) 0 | 95 | 5 6.5 | 62 | 38 10 | 62 | 38 12 | 40 | 60 15 | 40 | 60 15.5 | 95 | 5 20.0 | 95 | 5 7.3.2 测定 取标准系列溶液（4.10）和试样溶液（7.2）上机测定。以乳铁蛋白峰面积为纵坐标，以标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线，得到标准曲线回归方程。乳铁蛋白标准溶液的液相色谱图参见附录 A。 8 试验数据处理 试样中乳铁蛋白的质量分数 x 以毫克每千克 (mg/kg) 表示，按下列公式计算： x = (c × V3) / (m × V1 / V2) × 1000 式中： c —— 被测组分曲线计算浓度，单位为毫克每升 (mg/L)； V1 —— 样液过柱体积，单位为毫升 (mL)； V2 —— 试样处理液总体积，单位为毫升 (mL)； V3 —— 样液最终定容体积，单位为毫升 (mL)； m —— 试样质量，单位为克 (g)； 1000 —— 换算系数。 计算结果保留三位有效数字。 9 精密度 在重现性条件下获得的两次独立测试结果的绝对差值不大于算术平均值的 15%。