【团体标准】 体外测试 B16细胞黑素合成抑制实验

ICS 71.100.70 C26 T/SHRH 团体标准 T/SHRH 027-2019 体外测试B16细胞黑素合成抑制实验 In Vitro Test-Inhibition of Melanin Synthesis in B16 Cells Test 2019-12-30 发布 2020-01-30 实施 上海日用化学品行业协会 发布 目 次 前言 1 范围 2 原理 3 测试仪器 4 试剂 5 试验方法 6 结果计算 7 试验有效性验证 8 结果报告 前言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出规则起草。 本标准由上海日用化学品行业协会提出和归口。 本标准起草单位：上海家化联合股份有限公司、东阿阿胶股份有限公司、上海上美化妆品有限公司、上海创元化妆品有限公司、广东博溪生物科技有限公司、福建片仔廣化妆品有限公司、上海绿瑞生物科技有限公司、云南贝泰妮生物科技集团股份有限公司、上海清轩生物科技有限公司、上海天祥质量技术服务有限公司、上海日用化学品行业协会。 本标准主要起草人：陈媛祺、曹平、陈田、廖峰、陈静、廖筝筝、曾四立、吴梅芳、卢永波、陈贞明、谢阿贵、姜春鹏、赵奕竹、马骁、王飞飞、高宏旗、朱翠翠、李琼、金坚、陈亦华。 1 范围 本标准规定了B16细胞黑素合成抑制试验的基本技术要求，提供一种美白原料的细胞评估方法，适用于宣称通过抑制黑素生成而达到美白效果的原料的功效评价。 2 原理 B16小鼠黑素瘤细胞是常用的研究黑素生成的细胞模型，通过测定美白原料作用于黑素细胞后黑素合成量的变化，评价原料的美白活性。 3 测试仪器 3.1 分析天平：精度0.1mg； 3.2 CO2培养箱； 3.3 倒置显微镜； 3.4 离心机； 3.5 可调节移液枪：1000μL、200μL、50μL、10μL； 3.6 细胞计数器； 3.7 恒温水浴锅； 3.8 生物安全柜； 3.9 酶标仪。 4 试剂 除有另外说明外，所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T 6682规定的一级水，与细胞培养相关试剂、耗材均需经过无菌处理。 4.1 B16细胞； 4.2 细胞培养涉及试剂及耗材：1×PBS、细胞培养液（DMEM（1X，含4.5g/L D-Glucose）+10%胎牛血清+1%混合抗生素（100X））、0.25% Trypsin（1X）、6孔细胞培养板、96孔细胞培养板、细胞培养瓶； 4.3 黑素提取液：配制含有10% DMSO的1mol/L NaOH。 5 试验方法 5.1 细胞收集 吸掉培养瓶中的培养液，用1×PBS洗两遍，然后加入0.25% Trypsin（1X）（T25培养瓶中加入500μL，T75培养瓶中加入1mL），放入CO2培养箱中消化3-5分钟，显微镜下观察细胞脱离培养瓶后，即可加入5mL细胞培养液终止消化，并收集培养瓶中的细胞于离心管中，1000rpm离心3分钟。 5.2 细胞计数 弃去上清，细胞重新悬浮于离心管中，计数细胞浓度。 5.3 细胞铺板 用细胞培养液调整细胞密度至2.5×10^3个/mL，然后将细胞悬液铺于6孔板中，每孔2mL。 注：每次测试需设定阴性对照组、受试样品组和阳性对照组，每组均设立三个复孔。 5.4 样品配制 待测样品的浓度应选择不影响细胞生长的浓度，即为细胞的无毒浓度。 液体样品需过滤除菌，再用细胞培养液稀释至相应的浓度； 水溶性固体样品先用1×PBS溶解至高浓度，后过滤除菌，再用细胞培养液稀释至相应的浓度； 非水溶性的样品先用DMSO溶解至高浓度，再用细胞培养液稀释至相应的浓度，应保证最后培养液中所含的DMSO浓度不超过1%。 5.5 第一次换液 铺好的6孔板在37℃，5% CO2培养箱中放置20-24小时后，将细胞培养液换成含有受试样品的培养液，每孔2mL，继续培养48小时。 注：阴性对照组仅含细胞培养液，阳性对照组需要加入含有阳性物质的细胞培养液。 5.6 第二次换液 第一次换液48小时后，重复步骤5.4，更换细胞培养液，每孔调整为加入3mL含相应样品的培养液，在37℃，5% CO2培养箱中继续培养。 5.7 第三次换液 第二次换液72小时后，重复步骤5.4，更换细胞培养液，每孔加入3mL含样品的培养液，在37℃，5% CO2培养箱中继续培养。 5.8 检测 第三次换液48-72小时后（细胞融合率达到90%以上），测定细胞黑素含量。 用1×PBS洗两遍细胞，吸去PBS，每孔加入200μL 0.25%胰酶消化细胞，放入CO2培养箱中消化5分钟。 分两次加入2mL PBS吹打细胞，将细胞收集入离心管中，4000rpm离心5分钟。 尽量吸净离心管中PBS残液，在每管中加入200μL的黑素提取液，震摇均匀，放入80℃水浴中加热1小时。 冷却后，适度离心下管壁液滴，吹打均匀，吸取各离心管中的150μL溶液，移入96孔板中，酶标仪检测各孔405nm处吸光度。 6 结果计算 计算黑素合成抑制率： 抑制率(%) = [(C - T) / (C - Co)] × 100 ... (1) 式中： T —— 受试样品孔吸光度； C —— 阴性对照组吸光度的3次平均值； Co —— 黑素提取液本底吸光度。 7 试验有效性验证 7.1 每批次试验都须加入阳性对照组，要求每批次测试阳性对照均能检出抑制B16细胞合成黑素的效果，且与阴性对照相比，具有统计学差异，则认为试验系统有效。阳性对照可选择曲酸。 7.2 统计酶标仪测得的各组平行孔间吸光度的标准差（Standard Deviation，SD），并计算变异系数（Coefficient of Variation，C.V），C.V值须≤20%，则认为试验平行性有效。 8 结果报告