【团体标准】 畜禽养殖环节细菌耐药性监测方法

ICS 65.020.30 B43 T/ZNZ 浙江省农产品质量安全学会团体标准 T/ZNZ 044—2020 畜禽养殖环节细菌耐药性监测方法 Method for antibacterial resistance surveillance in livestock and poultry breeding 2020-12-08 发布 2021-01-08 实施 浙江省农产品质量安全学会 发布 前言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规则起草。 本文件的某些内容可能涉及专利。本文件发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由浙江省农产品质量安全学会提出并归口。 本文件起草单位：浙江省农业科学院农产品质量安全与营养研究所。 本文件主要起草人：杨华、唐标、王小骊、钱鸣蓉、吉小凤、吕文涛、肖英平、汪建妹、谈思敏、吴静、汪雯、肖兴宁、吴俐勤、李锐。 1 范围 本文件规定了畜禽养殖环节细菌耐药性监测的设备和材料、试剂和培养基、样品采集与保存、细菌分离鉴定与保存、抗菌药物敏感性试验、生物安全的要求。 本文件适用于畜禽源的大肠埃希氏菌、肠球菌和弯曲杆菌分离鉴定，及其抗菌药物敏感性试验（微量肉汤稀释法）。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 4789.1 食品安全国家标准 食品微生物学检验 总则 GB 4789.4 食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验 GB 4789.9 食品安全国家标准 食品微生物学检验 空肠弯曲菌检验 GB 4789.28 食品安全国家标准 食品微生物学检验 培养基和试剂的质量要求 GB 4789.38 食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠埃希氏菌计数 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室生物安全通用要求 SN/T 2206.5 化妆品微生物检验方法 第5部分：肠球菌 YY/T 1169 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 细菌耐药性 antibacterial resistance 细菌对抗菌药物不敏感的现象。 3.2 抗菌药物敏感性试验 antibacterial susceptibility testing 用于测试抗菌药物在体外对细菌有无抑制或杀灭作用的标准化试验，简称药敏试验。 3.3 最低抑菌浓度 minimal inhibitory concentration, MIC 体外能够抑制肉眼可见的细菌生长的最低药物浓度。 3.4 折点 breakpoint 用于判定测试菌株敏感（Susceptible, S）、中敏（Intermediate, I）和耐药（Resistant, R）的最低抑菌浓度。 4 设备和材料 开展细菌耐药性监测的微生物实验室应符合GB 19489生物安全二级实验室（BSL-2）要求，灭菌、培养和鉴定设备按GB 4789.1和GB 4789.9执行，其他设备如下： a) 微量移液器：0.1μL~2.5μL、0.5μL~10μL、10μL~100μL、100μL~1000μL； b) 电子天平：感量0.01g，感量0.00001g； c) 自动加样仪或多通道微量加样器：1μL～100μL； d) 厌氧培养罐； e) 麦氏比浊管和浊度仪：可测量范围麦氏浊度0.01～4.00； f) 核酸电泳仪； g) 凝胶成像系统； h) PCR扩增仪； i) 质谱鉴定仪：基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪，含常见病原菌数据库。 5 试剂和培养基 5.1 实验用水 实验用水应符合GB/T 6682和GB 4789.28的规定。 5.2 无菌生理盐水 称取0.9g氯化钠溶于100mL蒸馏水中，121℃灭菌15min。 5.3 抗菌药物 抗菌药物贮备液和工作液的制备与保存见附录A。 5.4 培养基 5.4.1 运送培养基的制备按GB 4789.28执行。 5.4.2 缓冲蛋白陈水的制备按GB 4789.4执行。 5.4.3 大肠埃希氏菌显色培养基（伊红美蓝琼脂培养基）的制备按GB 4789.38执行。 5.4.4 大肠埃希氏菌显色培养基（麦康凯琼脂培养基）的制备按YY/T 1169执行。 5.4.5 肠球菌显色培养基的制备按SN/T 2206.5执行。 5.4.6 LB琼脂培养基的制备按附录B.1执行。 5.4.7 Bolton肉汤（Bolton broth）的制备按GB 4789.9执行。 5.4.8 改良CCDA琼脂的制备按GB 4789.9执行。 5.4.9 哥伦比亚血平板的制备按GB 4789.9执行。 5.4.10 布氏肉汤的制备按GB 4789.9执行。 5.4.11 弯曲杆菌保藏液的制备按附录B.2执行。 5.4.12 MH肉汤（Mueller-Hinton broth）的制备按附录B.3执行。 5.5 质控菌株 5.5.1 大肠埃希氏菌（Escherichia coli，ATCC 25922）； 5.5.2 粪肠球菌（Enterococcus faecalis，ATCC 29212）； 5.5.3 空肠弯曲杆菌（Campylobacter jejuni，ATCC 33560）。 注：质控菌株在-70℃以下保存，传代不应超过5次。 6 样品采集与保存 6.1 样品采集 6.1.1 直肠/泄殖腔拭子采集 用无菌生理盐水或运送培养基浸润灭菌棉拭子，伸入家畜直肠或家禽泄殖腔1.5cm～2.0cm，旋转2圈~3圈，立即将棉拭子置于10mL运送培养基中。 6.1.2 新鲜粪便采集 用灭菌棉拭子蘸取新鲜粪便，不应沾有泥土或其他污染物，立即将棉拭子及样品置于10mL运送培养基中。对用于弯曲杆菌分离的样品，应采集成团或成堆的新鲜粪便样本。 6.1.3 盲肠内容物采集 用灭菌棉拭子蘸取盲肠内容物，立即置于10mL运送培养基中。对用于弯曲杆菌分离的样品，宜在屠宰时截取一段内容物丰富的盲肠段，结扎后置于无菌密封袋。 6.2 采样记录和标识 样品采集后应加盖密封，并加注样品标识，及时填写采样记录表。采样记录表和样品编码格式参见附录C。 6.3 样品保存 样品应置于2℃～8℃条件下保存，避免交叉污染。对用于弯曲杆菌分离的样品，保存过程应放置微需氧产气袋，以提高分离率。 6.4 样品运输 采集的样品由专人保管，按GB 4789.1要求运达检验单位，运输时间不超过48h。运输工具应保持清洁。运输和装卸过程中应防止包装破损，样品渗漏。 6.5 样品接收 实验室接收样品时，应确认样品完好情况、数量，交接双方签字确认。样品应立即开展细菌分离。 7 细菌分离鉴定与保存