【团体标准】 肉牛促性腺激素释放激素免疫去势技术规程

ICS 67.120.20 B 40 团体标准 T/SHZSAQS 014—2020 肉牛促性腺激素释放激素免疫去势技术规程 2020-12-26 发布 2020-12-31 实施 石河子市质量标准化协会 发布 前言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准附录A为资料性附录。 本标准起草单位：新疆农垦科学院畜牧兽医研究所、新疆天山军垦牧业有限责任公司。 本标准主要起草人：徐梦思、甘尚权、陈红莉、孟季蒙、吴妍妍。 1 范围 本规程规定了肉牛促性腺激素释放激素免疫去势的术语和定义、肉牛促性腺激素释放激素疫苗的制备方法、肉牛促性腺激素释放激素免疫去势程序、促性腺激素释放激素免疫效果评定等技术内容。 本规程适用于肉牛促性腺激素释放激素免疫去势。 2 术语和定义 以下术语和定义适用于本标准。 2.1 促性腺激素释放激素（GnRH） 促性腺激素释放激素是由下丘脑分泌的，能刺激或抑制垂体促性腺激素的神经激素，对动物生殖起重要调控作用。 2.2 GnRH短肽 天然的GnRH短肽是由谷氨酸、组氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、甘氨酸、亮氨酸、精氨酸及脯氨酸组成的10个氨基酸残基短肽。 3 肉牛GnRH疫苗的制备方法 3.1 GnRH疫苗的抗原表位 根据自然界中GnRH短肽序列，本标准在此基础上将第6位甘氨酸由D型赖氨酸取代，并通过改变构象，共设计3种GnRH抗原表位用于肉牛的免疫去势，分别为：二串子双半胱氨酸、二串子α螺旋、四串子α螺旋，详细抗原表位序列见表1。 表1 GnRH抗原表位序列 | GnRH抗原名称 | 氨基酸序列 | | :--- | :--- | | 二串子双半胱氨酸 | CQHWSYKLRPGQHWSYKLRPGC-NH2 | | 二串子α螺旋 | pEHWSYKLRPGMALQHWSYKLRPGC-NH2 | | 四串子α螺旋 | pEHWSYKLRPGMALQHWSYKLRPGALMQHWSYKLRPGLAMQHWSYKLRPGC-NH2 | 3.2 GnRH疫苗抗原与载体蛋白连接 GnRH抗原经高效液相色谱（HPLC）纯化后，纯度>90%，采用碳二亚胺法将GnRH抗原与大载体卵清蛋白（OVA）连接。GnRH抗原与OVA载体蛋白连接后构成GnRH-OVA复合物，偶联率达80%。 3.3 GnRH疫苗抗原乳化 将GnRH-OVA复合物溶于PBS（pH=7.4）中，用Span白油佐剂充分乳化。将制备好的乳化液密封后放置于4℃恒温环境中，观察乳液性状，无分层情况，性状保持良好；并将乳化液滴与纯净水上静置，无散开、破乳现象，说明该GnRH疫苗稳定性较好，可用于后期免疫去势。 4 肉牛GnRH免疫去势程序 4.1 免疫月龄 随机选取13月龄的需进行免疫去势的肉牛。 4.2 免疫注射方法及剂量 选择一次性注射器及针头，采取颈部皮下注射的方法免疫1 mL GnRH去势疫苗（含GnRH约500 μg）。在疫苗注射过程中要确保操作规范，避免注射到脂肪层造成疫苗的浪费，注射后要注意观察注射部位是否有起包等不良反应。在注射时要确保每头牛一个针头，避免交叉感染。 4.3 加强免疫时间及剂量 为了保证GnRH疫苗的免疫效果，初免后，间隔1个月以相同剂量与注射方法对肉牛进行一次强化免疫。免疫时要做好记录工作，包括牛的编号、免疫时间、免疫剂量、操作人员等。 4.4 GnRH免疫效果评定 4.4.1 临床评价 免疫去势后观察公犊牛的日常行为。发现未进行免疫的公犊牛会频繁出现爬跨现象，并且群体间有打斗攻击行为；而经GnRH主动免疫后的公犊牛无爬跨现象及攻击行为，但会出现被爬跨现象。出现以上行为说明GnRH疫苗主动免疫效果良好，能够有效地降低动物的攻击行为和性行为。 4.4.2 病理评价 取免疫与未免疫公牛单侧睾丸组织置于4%中性甲醛中固定。将睾丸组织进行组织石蜡切片，连续切10张6 μm厚度切片，经苏木素-伊红染色后，光学显微镜下观察。未免疫公牛睾丸组织中，曲细精管排列整齐，管腔内各级生精细胞层次清晰，层数正常，精原细胞向管腔内发育，分化为初级精母细胞、精子细胞和精子，精子数量较多，上皮组织完整，支持细胞和间质细胞分布均匀；而GnRH疫苗免疫后的公牛睾丸组织发生明显空泡变性，曲细精管生殖上皮明显萎缩，管腔内精原细胞、精母细胞及精子细胞减少或消失。 附录A（资料性附录） 肉牛睾丸组织切片 注：此处原文包含附录图片说明，具体切片图样请参考标准原文。