【团体标准】 肉牛促性腺激素释放激素免疫去势技术规程

ICS67.120.20
体标准
T/SHZSAQS014—2020
肉牛促性腺激素释放激素免疫去势技术规程
2020-12-26发布
石河子市质量标准化协会
2020-12-31实施
2术语和定义
2.1促性腺激素释放激素（GnRH）2.2GnRH短肽
3肉牛GnRH疫苗的制备方法
3.1GnRH疫苗的抗原表位
3.2GnRH疫苗抗原与载体蛋白连接3.3GnRH疫苗抗原乳化
4肉牛GnRH免疫去势程序
4.1免疫月龄
4.2免疫注射方法及剂量
4.3加强免疫时间及剂量，
4.4GnRH免疫效果评定
4.4.1临床评价，
4.4.2病理评价，
4.4.3疫苗评价
附录A（资料性附录）
肉牛睾丸组织切片
T/SHZSAQS0142020
T/SHZSAQS0142020
全国SHZSAOS
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准附录A为资料性附录。
本标准起草单位：新疆农垦科学院畜牧兽医研究所、新疆天山军垦牧业有限责任公司。本标准主要起草人：徐梦思、甘尚权、陈红莉、孟季蒙、吴妍妍。I
1范围
T/SHZSAQS0142020
肉生促性腺激素释放激素免疫去势技术规程本规程规定了肉牛促性腺激素释放激素免疫去势的术语和定义、肉牛促性腺激素释放激素疫苗的制备方法、肉牛促性腺激素释放激素免疫去势程序、促性腺激素释放激素免疫效果评定等技术内容。
本规程适用于肉牛促性腺激素释放激素免疫去势2术语和定义
以下术语和定义适用于本标准。2.1促性腺激素释放激素（GnRH）促性腺激素释放激素是由下丘脑分泌的，能刺激或抑制垂体促性腺激素的神经激素，对动物生殖起重要调控作用。
2.2GnRH短肽
天然的GnRH短肽是由谷氨酸、组氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、甘氨酸、亮氨酸、精氨酸及脯氨酸组成的10个氨基酸残基短肽。3肉牛GnRH疫苗的制备方法
3.1GnRH疫苗的抗原表位
根据自然界中GnRH短肽序列，本标准将在基础上将第6位甘基酸由D型赖氨酸取代，并通过改变构象本标准共设计3种GnRH抗原表位用于肉牛的免疫去势，分别为：二串子双半胱氨酸、二串子α螺旋、四串子α螺旋，详细抗原表位序列见表1。表1GnRH抗原表位序列
GnRH抗原名称
二串子双半胱氨酸
二串子α螺旋
四串子α螺旋
氨基酸序列
CQHWSYKLRPGQHWSYKLRPGC-NH
pEHWSYKLRPGMALQHWSYKLRPGC-NH2pEHWSYKLRPGMALQHWSYKLRPGALMQHWSYKLRPGLAMQHWSYKLRPGC-NH21
3.2GnRH疫苗抗原与载体蛋白连接T/SHZSAQS0142020
GnRH抗原经高效液相色谱（HPLC）纯化后，纯度>90%，采用碳二亚胺法将GnRH抗原与大载体卵清蛋白（OVA）连接，GnRH抗原与OVA载体蛋白连接后构成GnRH-OVA复合物，偶联率达80%3.3GnRH疫苗抗原乳化
将GnRH-OVA复合物溶于PBS（pH=7.4）中，用Span白油佐剂充分乳化，将制备好的乳化液密封后放置于4℃恒温环境中，观察乳液性状，无分层情况，性状保持良好：并将乳化液滴与纯净水上静置，无散开、破乳现象，说明该GnRH疫苗稳定性较好，可用于后期免疫去势。4肉牛GnRH免疫去势程序
4.1免疫月龄
随机选取13月龄的需进行免疫去势的肉牛。4.2免疫注射方法及剂量
选择一次性注射器及针头，采取颈部皮下注射的方法免疫1mLGnRH去势疫苗（含GnRH约500μg）。在疫苗注射过程中要确保操作规范，避免注射到脂肪层造成疫苗的浪费，注射后要注意观察注射部位是否有起包等不良反应。在注射时要确保每头牛一个针头，避免交叉感染。4.3加强免疫时间及剂量
为了保证GnRH疫苗的免疫效果，初免后，间隔1个月以相同剂量与注射方法对肉牛进行一次强化免疫。免疫时要做好记录工作，包括牛的编号、免疫时间、免疫剂量、操作人员等。4.4GnRH免疫效果评定
4.4.1临床评价
免疫去势后观察公续牛的日常行为，发现未进行免疫的公犊牛会频繁出现爬跨现象，并且群体间有打斗攻击行为，而经GnRH主动免疫后的公续牛无爬跨现象及攻击行为，但会出现被爬跨现象，出现以上行为说明GnRH疫苗主动免疫效果良好，能够有效的降低动物的攻击行为和性行为。4.4.2病理评价
取免疫与未免疫公牛单侧睾丸组织置于4%中心甲醛中固定，将睾丸组织进行组织石蜡切片连续切10张6um厚度切片，经苏木素-伊红染色后，光学显微镜下观察。未免疫公牛睾丸组织中，曲精细管排列整齐，管腔内各级生精细胞层次清晰断，层数正常，精原细胞向管腔内发育，分化为初级精母细胞、精子细胞和精子，精子数量较多，上皮组织完整，支持细胞和间质细胞分布均匀：而GnRH疫苗免疫后的公牛睾丸组织发生明显空泡变性，曲细精管生殖上皮明显萎菱缩，管腔内精原细胞、精母细胞及精子细胞2