【农业行业标准(NY)】 乳与乳制品中嗜冷菌、需氧芽孢及嗜热需氧芽孢数的测定

ICS 67.100.10
中华人民共和国农业行业标准
NY/T 1331—2007
乳与乳制品中冷菌、需氧芽孢及嗜热需氧芽孢数的测定
Enumeration of Colony of Psychrotrophic Microorganisms,Total Aerobic Bacterial Spores and Thermophilic AerobicBacterial Spores in Milk and Dairy Products(IS06730:1992 Milk-Enumeration of colony-forming umits of psyr:hrotrophic micrm-orgarisins-colony-count technique at 6.5°C; NEN68 13:1999 Milk and milk products-Determination of the content of spores ofmesophilic aerobic sporeforming hacteria:NEN6809:1999 Milk and rrilk prmducty-Delermination of the cu-ntent of thermophilic aerobhic sporrforming hactcria,NFQ)2007-04-17发布
2007-07-01实施
中华人民共和国农业部
NY/T1331—2007
本标准的起草参考了ISO6730：1992《乳一嗜冷微生物菌落计数一6.5菌落计数技术》（英文版）；荷兰国家标准NEV6813：1999《乳与乳制品一嗜中温需氧芽孢数的测定》（荷兰义版）；荷兰国家标准NEN6809:1999《乳与乳制品一嗜热需氧芽孢数的测定》（荷兰文版）。本标准与ISO6730：1992、NEN6813：1999、NEN6809:1999的-致性程度为非等效。本标准出中华人民共和国农业部提出。本标准出全国畜牧业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：农业部乳品质量监督检验测试中心。本标雄王要起草人：李奇英、马文宏、张华、王金华。I
1范围
NY/T1331—2007
乳与乳制品中冷菌、需氧芽孢及嗜热需氧芽孢数的测定第一部分；乳中晴冷菌数测定
本部分规定了乳中哗冷菌数的测定方法。本部分适用于生鲜乳及巴氏杀菌乳中冷菌数的测定。2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本部分的引用面成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文作，其最新版本适用于本部分。GB/T4789.1食品卫生微生物学检验总则GB/I4789.28一2003食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂3术语和定义
下列术语和定义适用于本部分。3.1
嗜冷菌psychrntrophic micronrganisms指在6.5C条件下,需氧培养10d,在MPC琼脂平板上形成可计数菌落的细菌、酵母和霉菌。3.2
MPC琼脂milk plate count agar乳平板计数琼脂。
4原理
检样在MPC琼脂内，于6.5亡条件下培养10d，菌落计数，算山每毫升检样中的嗜冷菌数。5稀释液和培养基
5.1蛋白陈-盐溶液
5.1.1成分
酶水解酪蛋白陈
氯化钠
蒸馏水
5.1.2制法
1000 mL
将酶水解酪蛋白陈和氯化钠溶解十蒸馏水中，用质量分数15%氢氧化钠溶液校正pH至7.0土0.1。分装试管和烧瓶，每管9mL、每瓶90mL或225ml，相对误差不超过=2%。密封后，121t±1℃高压灭菌15tnin
5.2磷酸盐缓冲液：按GB/T4789.28—2003中3.22规定逃行制备。5.3MPC琼脂培养基
NY/T1331—2007
5.3.1成分
胰蛋白藤
酵母浸膏
葡萄糖
脱脂奶粉
蒸馏水
注1:脱脂奶粉不应含有抗生素类物质。注2:琼脂用量根据其凝固程度决定。5.3.2制法
10 g～15
1 000 mL
将5.3.1中除琼脂以外的各成分溶解于蒸馏水中,用质量分数15%氢氧化钠溶液校正pH至7.0+0.1，加人琼脂，加热煮沸，便琼脂溶化。必要时使用两层纱布之间夹脱脂棉过滤，分装烧瓶。密封后，121T11℃高压灭菌15mir。若立即使用此培养基,在水浴(6.3)中将其冷却到45℃;否则,将灭菌后的培养基放丁暗处温度为0℃～5℃之间忙存，时间不超过30d。为了避免延误倾注培养基的时间，微生物检测之前，加热融化培养基。然后，于水浴(6.3)中冷却到45℃。6设备和材料
6.！微生物实验室常用设备和材料：6.2生化培养箱：6.5℃+0.5℃
6.3水浴锅:45t±1。
6.4无菌培养ml：直径90mm。
6.5无菌吸臂。
7取样
样品的采敢按（B/T 4789.1执行。8检测程序
嗜冷菌数检测程序见图1。
做成几个适当倍数的稀释液
选择三个适宜释度
各取 1mL分别加人无菌培养血内每血内加人适量MPC琼脂培养基
6.5t±0.5℃ 1 10 d
荫蒋计数
9操作步骤
9.1检样处理
NY/T 1331—2007
9.1.1快速翻转待检样品容器25次，使伴品混合均匀，避免形成泡沫：然后，以无菌操作打开样品包装容器。
9.1.2用无菌吸管(6.5)吸取1mL检样于含有9ml.无菌稀释液(5.1或5.2)的试管中(或10mL检样丁含有90tnL无菌稀释液的烧瓶中，或25m正检样于含有225rml.无菌稀释液的烧瓶中），经充分振摇获得10均与稀释液，
9.1.3劣川一支1mL无菌吸管吸取10-1稀释液1ml.加人到含有9mL无菌稀释液的试管中，振播试管，混合均匀，获得10-2稀释液。按上述操作方法，做10倍递增稀释。如此每递增稀释-次，即换用一支1mL无菌吸管。
9.2接种及培养
9.2.1根据对样品中嗜冷菌污染情况的估计，选择三个适宜稀释度，分别在做10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移1rnL该稀释液丁无菌培养Ⅲ（6.4)内，每个稀释度接种两个培养血。
9.2.2检查培养基(5.3)的温度不要超过46C：然后，立即倾注12nL～15mL培养基到每个培养血中。
9.2.3小心地转动培养血接种样和培养基混合均勾，水放置使混合窃凝固。从第-步稀释液的制备到接种样液和培养基混合所用的时问不得超过15min。9.2.4接种的同时,用1 ml.稀释液作空自试验。9.2.5待琼脂凝固后，堆叠培养Ⅲ，倒置在培养箱（6.2)中，于6.5°±0.5℃培养10d。培养而堆叠不超过6个。
9.3菌落计数
9.3.1做平板菌落计数时，可用肉眼观察，极微小的菌落也应计数在内，需要时用放大镜检查，9.3.2蔓延的菌落被认为是单一菌落，如果被蔓延菌落所盖的部分不到平板面积的1/4,计数未受影响的平板部分的菌落并计算出整个平板的相对量；如果被蔓延菌落所覆盖的部分超过了平板面积的1/4，不应计数
10结果计算
10.1保留含有10个～300个菌落的培养血。用公式(1)计算每毫升样品中的喏冷菌数N= (n, 10.1n2 + 0.01ns)d
式中：
N—样品中嗜冷菌数，cfu/mli
>。—所有保留培养血中计数菌落的总和；保留的含有10个--30个菌落的培养而中第一个稀释度的培养血数；n
保留的含有10个～300个菌落的培养Ⅲ中第二：个稀释度的培养血数；n2
n3——保留的含有10个～300个菌落的培养Ⅲ中第三个稀释度的培养血数；d第 个稀释度的稀释因数。
结果保留两位有效数字。
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示例：
嗜冷菌的菌落数给出如下结果（每个稀释度培养2个培养Ⅲ)：一在第一个释度下(10-2)含有168个和215个菌落：-在第二个稀释度下(10-3)含有14个和25个落；-在第三个稀释度下(10-4)少于10个菌落，Z
N=(m1 1 0.1n2+ 0.01ng)d
168 + 215 -1 14 -1 25
—0,022
(2 + 0.1 × 2) × 10-2
修约上述结果，样品中嗜冷菌数报告为19000或1.9×10°cfu/mL± 19 182
10.2如果所有稀释度培养血中菌落数均少于10 个,结果报告为“样品中嗜冷菌数小于10×1/d cfu/mL\,式中 d 为最低稀释被的稀释度。10.3如果所有稀释度养血中的菌落数均多于300个，从最接近300个菌落的培养血中计算出一个估计值乘以相应最高稀释度的倒数。结果报告为\每毫升样品中嗜冷菌数的估计值”11重复性
在重复性条件下两次独立谢试结果的绝对差值,不大于较低结果的30%，以大于较低结果 30%的情况不超过5%为前。
第二部分：需氧芽孢总数测定
1范围
本部分规定了乳与乳制品中需氧芽孢总数的测定方法。本部分适用于生鲜乳及其制品中氧芽孢总数的测定。2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本：凡是不注口期的引用文件，其最新版本适用于本部分。GB/T4789.1食品卫生微生物学检验总则GB/T4789.28一2003食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂3术语和定义
下列术语和定义适用于本部分。3.1
需氧芽孢总数total aerohic bacterial spnres指在有氧条件下，经80C加热处理10min，能存活并且于36C下培养48h在MIC琼脂平板上形成可计数的菌落总，
MPC琼脂milkplatccountagar
乳平板计数琼脂。
4原理
取-定量的液体检样或捡样的初级稀释液，将其在80℃下加热10min，在MPC琼脂内，于36C条件下培养48h，菌落计数，算出每毫升(克)检样中的需氧芽孢总数。4
5稀释液和培养基
5.1蛋白陈-盐溶液
5.1.1成分
酶水解酪蛋白陈
氯化钠
蒸馏水
5.1.2制法
1 000 ml
NY/T1331—2007
将酶水解酪蛋白陈和氯化钠溶解于蒸馏水中，用质量分数15%氢氧化钠溶液校正pH至7.0土0.1。分装试管和烧瓶，每管9mL、每瓶90mL或225mL，相对误差不超过±2%。密封后，121C±1℃高压灭菌15mina
5.2磷酸盐缓冲液：按GB/T4789.28—2003中3.22规定进行制备，5.3MPC琼脂培养基
5.3.1成分
胰蛋白
酵母浸膏
葡萄糖
脱脂奶粉
蒸馏水
注 1;脱脂奶粉不应含有抗生素类物质,注2：琼脂用量极据其凝固程度决定。5.3.2制法
10 g～15 g
1 000 mL.
将5.3.1中除琼脂以外的各成分溶解于蒸馏水中,用质量分数15%氢氧化钠济液校止pH至7.0士0.1。加人琼脂，加热煮沸，使琼脂融化。必要时使用两层纱布之问夹脱脂棉过滤，分装烧瓶。密封后，121七±1t高压灭菌15min。若立即使用此培养基,在水浴(6.3)中将其冷却到45七。否则,将灭菌后的培养基放于暗处温度为0℃~·5℃之间贮存，时间不超过30d。为了避免延误倾注培养基的时间，微生物检测之前，加热融化培养基。，然后，于水浴(6.3)中冷却到45C。6设备和材料
6.1微生物实验室常用设备和材料。6.2培养箱：36t+1℃。
6.3 水浴锅:45±1t。
6.4 水浴锅:80℃ 11℃.
6.5无菌培养m：直径90mmc
6.6无菌吸管。
6.7无菌试管。
7取样
样品的采取按（GB/T4789.1执行。8检测程序
需氧芽孢总数检测程序见图2.
NY/T 1331—2007
9操作步骤
9.1捡样处理
固体检样10g+稀科液90mL
80元，加热10m
液体检择
懒成几个适当倍数的希释
选择适立稀释度
各取1ml.分别加人无菌培养血内+
街血内加人适量MPC琼脂培养基
36°℃±1℃48h±2h
菌幕计数
9.1.1以无菌操作打开待检样品包装容器液体样品应避免形成泡沫。9.1.2以无菌操作称取固体或半固体检样10g（或25g）于含有90mL（或225mL)预热至45的灭菌稀释液（5，1或5.2）的三角烧瓶中（瓶内预置适当数量的玻璃珠），经充分振摇（必要时用均质器均质或无菌乳钵研磨)制成101初级稀释液。9.2加热处理
9.2.1用无菌吸管(6.6)吸取液体检样、固体或-半固体检样的初级稀释液5ml.-10)ml于无菌试管(6.7)中,注意不应使样液接触剑超出水面和位于水面下2 cm以内的试管内壁。9.2.2立即将上述试管放人80℃±1七的水浴(6.4)中，使试管内液面至少低于水面4cm。9.2.3加热处理10min二1min。在对照管中放一支温度计测定温度。试管内样液的升温时间不应超过5min
9.2.4将加热处理后的试管取山立即放到20℃以下的流水中冷却，9.3进一步稀释液的制备
用支1mL无菌吸管(6.6),吸取1mL经加热处理的样液，丁含有9mL无菌稀释液的试管中,振摇试管，混合均勾，获得其10倍稀释液（液体检样10-稀释液或固体检样10-2稀释液)。按上述操作方法，做10倍递增稀释，如此每递增稀释一-次，换用一支1mL无菌吸管。9.4接种和培养
9.4.1根据对样品中芽孢含最的估计，选摔适宜的释度，即通过正确地选择，使得在培养结束后至少有一个培养血里长出10个150个菌落。分别在做10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移1mL该稀释液于无菌培养而内，每个稀释度接种两个培养Ⅲ9.4.2立即倾注12mL~15mL已融化并冷却至 45℃±1C的 MPC琼脂培养基到每个培养血中。6
NY/T1331—2007
9.4.3小心地转动培养血使接种样液和培养基混合均勾，水平放置使混合物凝固。从热处理结束到接种样液和培养基混合所用的时间不得超过15mins9.4.4接种样液的同时,用1 mL稀释液,作空白试验。9.4.5待琼脂凝固后,堆叠培养匪，倒置在培养箱(6.2)中，于36±1C培养48h±2h。注：为了避免菌落茎延使得无法计数，可采敢以下措施：一待培养Ⅲ里的混合物凝固后，于其上再铺一层(约5 mL)还保持液体状态的该培养基；待培养亚里的混合物凝固后，翻转培养而，}培养而的盖子里放一片滤纸并在滤纸上滴几滴甘油。9.5菌落计数
9.5.1做平板荫落计数时，可用肉眼观察，需要吋用放人镜检脊。9.5.2蔓延的菌落被认为是单菌落，如果被蔓延菌落所覆盖的部分不到平板面积的1/4，计数未受影响的平板部分的菌落并让算出整个平板的相对量。如果被蔓延菌落所爱盖的部分超过了平板面积的1/4,不应计数。
10结果计算
10.1保留含有10个150个菌落的培养血。用公式(2)计算每毫升或每克样品中需氧芽孢总数N
(ni+0.1nz)d
式中：
N——样品中需氰芽孢总数,cfu/mL(g)：。—所有保留培养Ⅲ中计数菌落的总和；n1——保留的含有10个～150个菌落的培养血中第一个稀释度的培养血数；保留的含有1)个150个菌落的培养血中第二个稀释度的培养血数：n2
d一第一个稀释度的稀释因数。
结果保留两位有效数字。
示例：
需氨芽孢总数测定给出如下结果(每个稀释度培养2个培养血)：在第一个稀释度下(100)含有 86个和 101 个菌落;—一在第二个稀释度下(10-)含8个和12个菌落。e
N- (1)2 (20.10 -2- 94.8
86+101+12
修约上述结果,样品中芽抱总数报告为95或9.5×10cfu/ml. (2)
10.2如果所有稀释度培养Ⅲ中菌落数均少十10个，结果报告为“样品中需氧芽孢总数小于10×1/dcfu/mL(g)\,式中 d 为最低稀释液的稀释度。10.3如果所有稀释度培养Ⅲ中的菌落数均多于150个，结果报告为“样品中需氧芽孢总数大下150×1/d cfu/mL(g)”,式中d为最高稀释液的稀释度。第三部分：嗜热需氧芽孢数测定1范围
本部分规定了乳与乳制品中嗜热需氧芽孢数的测定方法本部分适用丁生鲜乳及其制品中嗜热需氧芽孢数的测定。7
NY/T 1331—2007
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本部分GB/T4789.1食品卫生徽生物学检验总则GB/T478928-—2003食品_卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂
3术语和定义
下列术语和定义适用于本部分：3.1
暗热需氧芽孢thermophilicaerobicbacterial spores指在有氧条件下,经100r加热处理30min,能存活并H于-55T:下培养48h在DTA平板,上形成可计数菌落的微生物。
DTA-dextrose tryplone agar
葡萄糖胰蛋白豚琼脂。
4原理
取一定量的液休检样或检样的初级稀释液，特其在100℃下加热30min，在IDTA培养基内，于55条件下培养48h，菌落计数，算出每毫Ⅱ克)检样中的嗜热需氧芽孢数。5稀释液和培养基
5.1蛋白陈-盐溶液
5.1.1成分
酶水解酪蛋白陈
氯化钠
蒸馏水
5.1.2制法
1 000 r.1
将酶水解酪蛋白陈和氯化钠溶解于蒸馏水中，用质量分数15%氢氧化销溶波校正pH至7.0工0.1分装试管和烧瓶，每管9ml每瓶90ml.或225mL，相对误差不超过±2%。辫封后，121土1七高压灭菌15mins
5.2磷酸盐缓冲液：按GB/T4789.28—2003中3.22规定进行制备。5.3 DTA 培养基
5.3.1成分
胰蛋白陈
葡萄糖
2%溴甲酚紫乙醇济液
蒸馏水
注：琼脂用量恨据其凝同程度决定。5.3.2制法
10 g- 15g
1000mL
NY/T 1331—2007
将5.3.1中除琼脂以外的各成分溶解于蒸馏水中,用质量分数15%氢氧化钠溶液校正pH至6.9土0.1。加入琼脂，加热煮沸，使琼脂溶化，分装烧瓶。密封后121七11℃高压灭菌15min。若立即使用此培养基，在水浴（6.3)巾将其冷却到45℃；否则，将灭菌后的培养基放于暗处温度为0℃5℃之间贮存,时问不超过30d。为了避免延误倾注培养基的时间，微尘物捡测之前,加热融化培养基。然后，于水浴(6.3)中冷却到45℃。
6设备和材料
6.1微生物实验室常用设备和材料。6.2培养箱：55℃±1℃，
6.3水浴锅:45±1
6.4无菌培养：直径90mm。
6.5无菌吸管。
6.6无菌试管。
7取样
样品的采取按GB\4789.1执行。8检测程序
嗜热需氧芽孢数检测程序见图3.检样
阔休检样 10 g+稀释液 90 mL
100℃，加热30min
腋液休检样wwW.bzxz.Net
做或几.个适当倍数的稀释液！
选祥适宜稀释度
各取1mL分别加人无菌培养内
每而内加人适量DTA培养基
55%+19: ↓ 48 h+2 h
菌落计数
9操作步骤
9.1检样处理
9.1.1以无菌操作打开待检样品包装容器，液体样品应避免形成泡沫，9.1.2以无菌操作称取固体或半固体检样10g（或25g）于含有90rmL（或225mL）预热至45℃的灭菌9
NY/T1331—2007
稀释液（5.1或5.2)的三角烧瓶中（瓶内预置适当数量的玻璃珠），经充分振摇（必要时用均质器均质或无菌乳钵研磨）制成10-1初级稀释液。9.2加热处理
9.2.1用无菌吸管（6.5)吸取液体检样、固体或半固体检样的初级稀释液5mL~10mL于无菌试管(6.6)中，注意不应使样液接触到超出水面利位丁水面下2cm以内的试管内壁：9.2.2立即将上述试管放入100℃的水浴中，使试管内液面至少低于水面4cm。9.2.3加热处理30min土1min，从成管放人100水浴中开始时。9.2.4将加热处理后的试管取出立即放到20以下的流水中冷却。9.3进一步稀释液的制备
如果有必要,取支1 mL无菌吸管,吸取 1 mL经加热处理的样液于含有 9mL无菌稀释液的试管中，振摇试管，混合均匀，获得其10倍稀释液（液体检样10-1稀释液或固体检样10-2稀释液）。9.4接种和培养
9.4.1根据对样品中嗜热需氧芽抱含量的估计，选择适宜的稀释度，即通过正确地选择，使得在培养结束后至少有--个培养Ⅲ里长出10个-150个菌落。分别在做10倍递增稀释的同时,即以吸取该稀释度的吸替1mL该稀释液于无菌培养血内，每个稀释度接种两个瑙养咀。注：在每毫升（克)乳或乳制品中，常常只有少量的嗜热需氧芽抱。如果想测出它们的数量，可以采取以下措施：一在多个培养而里接种足够量的经加热处埋的液体伴品或经加热处理的初级稀释液；一使用更大的培养Ⅲ，以能够在其中接种多于1mL经加热处理的綫体样品或经加热处理的初级稀释液。在报告结果时，必须要准明对检测方法进行的调整。9.4.2立即倾注12mL～1.5mL已融化并冷却至45七上1℃的DTA培养基到每个培养血中。9.4.3小心地转动培养血使接种样液和培养基混合均勾，水平放置使混合物凝固。从热处理结束到接种样液和培养基混合所用的时问不得超过15min9.4.4接种样液的同时,用1mL稀释液作空白试验9.4.5待琼脂凝固后，堆培养血，把其倒置在塑料袋里，然后将其放人培养箱(6.2)中，丁55七11C培养 48 h±2 h。
注：为了避免菌葬蔓延使得无法计数，可来取以下措施：一待培养血单的混合物凝固后，于其工再铺一层（药5m)还保持较休状态的该培养基：一待培养肌里的混合物凝后，翻转增养血，于培养血的盖于里放一片滤纸并在滤纸上滴几滴古油。9.5菌落计数
9.5.1做平板菌落计数时，可用肉眼观察,需要时用放大镜检查。9.5.2蔓延的菌落被认为是单--菌落。如果被蔓延菌落所覆盖的部分不到平板面积的1/4,计数未受影响的平板部分的菌落并算出整个平板的相对量。如果被蔓延菌落所覆盖的部分超过了平板面积的1/4,不应计数。
10结果计算
10.1保留含有10个～150个菌落的培养血：用公式(3)计算每毫升或每克样品中的嗜热需氧芽孢数：e
(n10.1n2)d
武中：
N——样品中的嗜热需氧芽孢数，cfu/mL(g)；>。所有保留培养皿中计数菌落的总和；10
... 3)
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