【农业行业标准(NY)】 犬传染性肝炎诊断技术

ICS 11.220
中华人民共和国农业行业标准
NY/T683—2003
犬传染性肝炎诊断技术
Diagnostic technigues for infectious caninc hepatitis2003-07-30发布
中华人民共和国农业部
2003-10-01实施
本标准的附录 A为规范性附录。前言
本标准出农业部畜牧兽医局提出并叮口。本标准起草单位：农业部兽医诊断中心。木标主要起草人：田克茶、工宏伟、遇秀玲、陈西钊、T传彬、杨秀网NY/T683—2003
１范围
犬传染性肝炎诊断技术
NY/T 6832003
木标谁规定了犬传染性肝炎（H)的临床诊断、大传染性肝痰滤毒（I的分离与鉴定、醇联负疫吸附试验和免疫酶组织化学方法等诊断技术：本标准适用大传染性汗炎的诊断2临床诊断要点
2. 1临床症状
最急性病例，患犬在呕叶,腹病和腹泻等猎状山现后数小斥内死亡，急性型病例：患犬体温呈马赖我升高精神迎郁食欲废绝,渴微增却,呕吐，版泻、粪中带血，业急性病例特征性症状足想犬角膜过性混浊,即谥眼”病，有的山现溃疡，慢性病例多发于老疫区或疫病流行后期，患大多不死亡，可以自愈。
2.2病理变化
病犬主要表现全性败血症变化：在实质群官浆膜，粘膜上可见大小数量不等的出正离点，肝肿大，旱斑驳状，表面有纤维素附养，删亵壁水肿增厚.灰门，半透明，咀囊浆膜被爱纤继素性渗山物，肌案的变化具有定的诊断意义，3病毒分离与鉴定
3.1材料准备
3. 1. 1试剂
3.1.1. 1改良最低要素营养液([MEM)培养基,配方见第A.1章.3.1. 1.2大臂传代细(MLXCK 组胞）、3.1.1.3标准阴性而清：1C11V单克降抗体，中和抗体效价1：1924，标准阴性血清;无ICIIV 感势的大清。3. 1. 1. 4
3. 1. 1. 5
新生叶血清,青需素链霍素。
3.1.2器材
细胞培养瓶；
吸督：
二氧化碳培养箱：
37℃恒湿水浴箱；
普通冰箱及低温冰箱：
离心机及离心管：
研磨器械：
浩通光学显徽镜；
微量加样幕,容量 5μL~50μL,50 L-~200μL0.45um微孔滤膜
3.1.3样品
ICHV存在于病大扁桃体、肝脏.脾脏等组织器言中无菌采集这些器它出无兰清MEM制成20%红织悬液.3000 r/min离心30 min：收上清10 000 r/min离心20 znin.段‘清月于 JCHV分离，1
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3.2操作方法
3.2.1细胞培养
用含8头新生牛血清的DMEM培养韩，在$7℃:培养MTCK组胞。每3d~4传代次，细胸民成单层时，而于[CIV分离。
3.2.2病料接种
将0.m！处理好的组织愁液接种MDCK细胞.37T吸附1h，加人无血清DMFM继续培养3~5d.观结果。
3.2.3结果观察
ICHV感染MDK细胞3l～5c表现为组跑增大变厕、变亮、折光性增强、聚集成葡悄串状。第恢接种长出现细胞病变,应将细孢培养物冻融后肯传=代：如仍无卵胞病变，则判为ICHV检3.2.4[CHV的鉴定
将汁现组病变的细胞培养物.用%人“)\型红细跑进行血凝试验，血凝试验阳性者，再用ICHI单克降烈本近行血凝抑试验，鉴宋毒株。4酶联免疫吸附试验
4.1材料准备
4.1.1试剂
4.1.1.FI.ISA抗原包被板
4.1.1.2标准阳性血清：用ICHV抗原免疫大获得的血清，4..1.3标准附证血清：无HV感染的大血清萌结介物：激根过氧化物嗨（HRP)标记兔流犬IgG4. 1. 1.4
4. 1. 1.5磷酸盐缓冲液(PRS):配例见第4. 2 帝。洗涤液：配制见第A.3章。
4. 1. 1.6
4. 1. 1.7详品稀释液:配制见第 A。2章。4.1.1.8物液：配制见第A.6章
4.1.1.9终止液配制见第A. 7章。4.1.2器材
s）联检测仪：
微量器，量50l~20Ga：
）37C恒温培养粘：
4.1.3样品
采集被检犬血没，分离血清。血清应新鲜、透阴、不溶机、无污染，密装于灭菌小瓶内，或30%保存或立即送检。试验前将被检血消统·编号，并用样品稀释液作1：160倍释，4.2操作方法
4. 2. 1试验设阴性对照、阳性对照各两孔和空内对照一孔4.2. 2在微孔反应板孔中删人1：160稀释的待检血清、阴性对照血清阳性对照血清各10) . 无混匀后，置37℃作 20 min。
4.2.3奔云各孔中液体、甩下，每孔灿满洗涤液漂洗三次，每次？Imin.甩7。4.2.4短孔加人酶结合物10μl.，置37℃作用20min，4.2.5重复4.2.3
4.2.6每孔加人底物液100I置37避光显色10mim4.2.7每孔加人终止液50μL.置酶联检测仪T-45mm波长测定各孔吸光度（OT)值：2
4.3结果判定
4.3.1阳性对血清（)D值0.8刚对照血清I）值0.1，试验成立。4. 3.2若阴性对照0D均值一空台刘照(I)值小下0, 03.按0. 03 计算。NY/T683—2003
4.3.3临界值的计算：临界值=0.17+（门性i消对照孔01)均俏一空白对照孔（))值）4.3.4待检样本的O1）值一范自对照（1）值所得的差临界值即判为1CHV抗体具有采打效价：小于临界，即判为1V抗体未达到保护效价5 免疫酶组织化学法
5.1材料准备
5. 1. 1 试剂
5. 1. 1. 1 磷酸盘缓冲液(PL3S):制见第 A. 2 章5.1.1.2标准阳I性血清：I:HV单克降抗体，中和抗体效价1：1524.5.1.1.3标准阴性血清：加1CHV感染的犬血清5, 1, 1. 4
酶结合物：HRP标记的 SPA：
5.1. 1.5底物溶液:配制见第A,8 章。5.1.1.6过包化氧中醇溶液：配制见第1.9章，5. 1. 1. 7
盐酸精溶液：配制见第A，10章。5. 1. 1. 8
胰蛋酶液：配制见第A，11辛，
5.1.2器材
a）普通光学显微镜：
微量加样器，溶量50l~-20g1
石螃切片机或冷冻坝划片桃：
d）载玻片皮盖啵片：
）37恒温培养箱或水溶箱：
5.1.3样品
刘疑似ICHV的病死犬或补系大，立即采集肝、篇桃体等组织数小块，置冰瓶内立即送检。不能立即送检者，将组织坎切成1cm1rm右大小，举休租分数为105的福尔马林溶液中固-保行送检。
5.2操作方法
5.2.1新鲜组织按常规方法制备冰冻划片，冰冻切片风干后用内酮固定10min*~15nin：新鲜组织或医定组织按常规力法制备石蜡创件，常带规脱蜡伞3S（切片应用白胶或铬研明胶做粘合剂，以防脱产）5.2.2去内源嗨：用过氧化氢中醇溶液或盐酸酒精溶液37C作而20min5.2.3胰盐酶消化：空温下数蛋白嗨溶液消化处埋2min.以便充分暴露抗原，漂洗：PBS漂光兰次，每次：min5.2.4
封闭：滴加体积分数为5%的新牛牛血清或！：10稀释的正常马血清.37湿盒中3：min。5.2.6加适当稀释的标准阳性而消或标准阴性血清，37*.湿盒中作用1或37%滤净=冶司33mn后1过峻
5.2. 7漂洗间 5. 2. 4,
加适当稀释的摘结合物，37℃湿盒作用175. 2. 9 源洗尚 3. 2. 4。
5.2.10底物显色：新鲜配制的底物溶液显色5min0min后.川P溅两，2高子水漂洗次。5.2.11村染：尔不素或平基绿衬染细胞核或灿胞质。5.2.12从93%乙醇开始脱水、透明、封片、首通光学显微镜现察：3
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5,2.13试验同时设阳性对照和阴性对照，5.3结果判定
阳性和阴性对照熙片本底清晰，背景无非特异着染，阳性对照组织细胞胞浆幸黄色至棕褐色着养染，试验成立：被检组织细胞胞浆、偶见胞核呈黄色至棕褐色誉染，即叮判为HV抗原阳性。6综合判定
当在临床「怀疑有ICHV感染时，川根据实际情况在上述方法中选一种或两种方法进行确诊。于末接种过ICHIV疫前的犬，采用任何一种方法检测圣现阳性结果时，都可最终判定为ICIIV感染人：对于接种过1CHV疫苔的大.当病毒分离鉴定试验为可I性结果时可最终势定为ICHIV感染火：当采用酶联免疫吸附试验检测血清抗体早现阳性结果时.可判为IC:HV抗体H有保护效价：呈现阴性结果时，可判为CHV抗体未达到保护效价
A.1DMEM(高糖)培养液
附录A
(规范性附录）
试剂的配制
A,1、1量取大离子水950 ml,置于适宜的容器中A.1.2将1)MEM粉剂10 g邮于30%.的去离了水4边加选搅撑A. 1.3每1 ) rmT.培养液所 3.？碳酸氢钠。NY/T 683—2003
A. 1. 4 期么离子水至 1 00U mL 用 1 Imol1/L 氧氧化钠或盐酸将培养波 PFI 值调至 pII5. 9--7. 0.盖紧容器瓶赛。bzxz.net
A,1.5即用孔径 0.5 μr的微孔滤膜正压过滤除菌,4:冰箱保存备用。A. 2磷酸盐缓冲液(PBS,0. 01 mul/1 pH7. 4)氮化钠
氨化钾
磷酸氢钾
十二水磷酸氢二钠
蒸馏水
洗涤液
叶温20
A.4样品稀释液
含体积分数为10%新生牛血清的洗涤液。磷酸盐-柠檬酸缓冲液（pH5.0）A.5
柠檬酸
「二水磷酸氢一钠
蒸溜水
ELISA底物溶液
加至1 000 m
1 oc0 mnl.
用-币鼎业砜将33-四甲基联苯胺（TM)配成1浓度.C保存、使用时较：：引物溶液：
磷酸盐-柠漆酸缓冲液
[%3'3'5'5\-四甲瑞联采胺
0不双氧水
.1 ml.
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终止液（2mol/L硫酸）
蒸馏水
免疫酶组织化学底物溶液
3,3 二胺基联苯胺盐酸盐(DAI3)PBS
30关过氧化氢
游纸过滤后使用,现用现配。
过氧化氢甲醇溶液(0.3%）
39终过氧化氢
现用现配。
盐酸酒精溶液（1%）
70%乙醇
映蛋白酶溶液（0.5%）
胰蛋白酶
低溢保存。使用时，用P13S稀释为0.05必，6
.! mt.
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中华人民共和国农业
行业标
犬传染性肝炎诊断技术
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中国标理出版社出版
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