【农业行业标准(NY)】 鸡传染性贫血诊断技术

本标准的附录A为规范性附录。
本标准由农业部畜牧兽医局提出并归口。本标准起草单位：农业部兽医诊断中心。本标准主要起草人：王宏伟、吴清民、田克恭、陈西钊、苏敬良、王传彬。NY/T681—2003
1范围
鸡传染性贫血诊断技术
NY/T 681-2003
本标准规定了鸡传染性贫血(CIA)的临床诊断、CIA病毒的分离与鉴定、酶联免疫吸附试验和免疫酶试验等诊断技术。
本标准适用于CIA的诊断。
2临床诊断
2.1临床症状
2.1.1CIA的主要临床特征是贫血。病鸡表现精神萎靡、虚弱、聚堆及行动迟缓，羽毛粗乱，喙、肉髯、面部和可视黏膜苍白，羽部有出血病灶，生长不良，排白稀粪。2.1.2产蛋种鸡感染无临床症状，产蛋率、受精率和孵化率均不受影响，但可通过种蛋传播病毒2.1.3当有马立克氏病、传染性法氏囊病等免疫抑制性疾病发生时，维鸡对鸡传染性贫血病毒(CIAV)的易感性增高,发病早且严重。2.2病理变化
2.2.1病鸡表现再生障碍性贫血，消瘦，骨髓发白，肌肉及内脏器官苍白，肝脏、肾脏肿大并褪色，血液稀薄,凝血时间延长。
2.2.2病鸡表现全身性淋巴组织萎缩，胸腺、法氏囊、脾脏和盲肠、扁桃体以及其他组织内淋巴细胞严重缺失。
3 病毒分离与鉴定
3.1材料准备
3.1.1试剂
a）改良最低要素营养液（DMEM)培养基，配方见第A.1章；b）马立克氏病病毒转化的淋巴细胞系MDCC-MSB1细胞；标准阳性血清：用CIAV抗原免疫SPF鸡获得的血清；c）
d）标准阴性血清：无CIAV感染的SPF鸡血清；e）
新生牛血清、青霉素、链霉素。3.1.2器材
细胞培养瓶：
b）吸管；
二氧化碳培养箱；
37℃恒温水浴箱；
普通冰箱及低温冰箱；www.bzxz.net
f）离心机及离心管；
研磨器械；
h）普通光学显微镜；
微量加样器，容量5μL~50μL，50μL~200μL；i
j）0.45μm微孔滤膜。
3.1.3样品
NX/T 681—2003
CIAV存在于病鸡肝脏、皮肤、脾脏、心脏、胸腺、肺脏、法氏囊、骨脏、骨髓等组织器宫中。无菌采集这些器官，用无血清DMEM制成20%组织悬液，以3000r/min离心30min。取上清70℃下处理5min后加等量10%三氯甲烷室温处理15min，以10000r/min离心20min，取上清用于CIAV分离。3.2操作方法
3.2.1细胞培养
用含15%新生牛血清的DMEM培养基在39C和5%二氧化碳环境下培养MDCC-MSBI细跑。每2d～3d传代-次，细胞长至2×10″个/mL～5×10°个/mL时，用于CIAV分离。3.2.2病料接种
将0.1mL处理好的组织悬液接种MDCC-MSB1细胞，在39℃和5%二氧化碳环境下培养48h，观察结果。
3.2.3结果观察
CIAV感染细跑表现为细胞体积增大，随之溶解，若第一次接种未出现细胞病变，应将细跑培养物冻融后盲传三代。如仍无细胞病变，则判为 CIAV检测阴性。3.2.4 CIAV的鉴定
将出现细胞病变的细胞培养物，按第5章的方法制备细胞涂片，用CIAV标准阳性血清进行签鉴定。4酶联免疫吸附试验
4.1材料准备
4. 1.1 试剂
a）ELISA抗原：CIAV抗原包被酶标板；b）F
阳性血清：用CIAV抗原免疫SPF鸡获得的血清；阴性血清：无CIAV感染的 SPF鸡血清；酶结合物：辣根过氧化物酶（HRP）标记抗CIAV单克隆抗体：d
磷酸盐缓冲液(PBS)：配制见第A.2章；洗涤液：配制见第A.3章：
样品稀释液：配制见第A.4章；
底物溶液：配制见第A.6章；
终止液：配制见第A.7章。
4.1.2器材
a）酉
酶联检测仪；
微量加样器，容量50μ～200μ；b）
s）37°C恒温培养箱。
4.1.3样品
采集被检鸡血液，分离血清，血清应新鲜、透明、不溶血、无污染，密装于灭菌小瓶内，4C或一30℃保存或立即送检。试验前将被检血清统一编号，并用样品稀释液作10倍稀释。4.2操作方法
4.2.1取出包被板，并将样品位置准确记录在记录单上。4.Z.2向A，、A2孔中分别加人100pL未经稀释的阴性对照血湾，A，、A孔中分别加人1DDαL未经稀释的阳性对照血清，其他各孔加人100叫l，稀释好的待检样品，每一样品加两孔。4.2.3置室温1h。
4.2.4用洗涤液将反应板洗涤(3~5)次。4.2.5每孔加人100μL酶结合物。4.2.6置室温30min
4.2.7重复4.2.4。
4.2.8各孔加人100μL底物液。
4.2.9室温放置15min。
4.2.10各孔加人100μL终止液，立即用酶标仪于波长650nm测定各孔OD值4.3结果判定
NY/T681--2003
4.3.1标准阴性血清OD值大于等于0.6,标准阳性血清OD值一标准阴性血清OD值小于等于0.50，试验成立。
4.3.2计算待检血清S/N值：S/N等于待检血清OD值一阴性血清OD值。4.3.3S/N小于等于0.6为CIAV抗体阳性，S/N大于0.6为CIAV抗体阴性。5免疫酶试验
5.1材料准备
5.1.1试剂
5.1.1.1磷酸盐缓冲液（PBS)：配制见第A.2章。5.1.1.2抗原涂片的制备：MDCC-MSB1细胞用含15%胎牛血清DMEM培养基培养，细胞长至5X105个/mL，接种CIAV并换成含5%新生牛血清的DMEM培养基，培养36h～48h，病变达50%～75%时,离心收集感染细胞,PBS洗涤三次后，稀释至细胞为1×10°个/mL。取印有10个～40个小孔的室玻片，每孔滴加10μL。室温自然干燥后，冷丙酮（4℃）固定10min。密封包装，置一20℃备用。5.1.1.3标准阳性血清：用CIAV抗原免疫SPF鸡获得的血清。5.1.1.4标准阴性血清：无CIAV感染的SPF鸡血清。5.1.1.5酶结合物：HRP标记抗CIAV单克隆抗体。5.1.1.6底物溶液：配制见第A.8章。5.1.2器材
a）普通光学显微镜；
印有10个～40个小孔的室玻片；b）
微量加样器，容量5μL～50μL；）
d）37℃恒温培养箱或水浴箱。
5.1.3样品
采集被检鸡血液，分离血清，血清应新鲜、透明、不溶血、无污染，密装于灭菌小瓶内，4℃或一30℃保存或立即送检。试验前将被检血清统--编号，并用PBS作10倍稀释。5.2操作方法
5.2.1取出抗原涂片，室温干燥后，滴加10倍稀释的待检血清和标准阴性血清、标准阳性血清，每份血清加两个病毒细胞孔和一个正常细胞孔，置湿盒内，37℃30min。5.2.2PBS漂洗三次，每次5min室温干燥。5.2.3滴加适当稀释的酶结合物，置湿盒内，37℃30min。5.2.4PBS漂洗三次，每次5min。5.2.5将室玻片放人底物溶液中，室温下显色5min～10min。PBS漂洗两次，再用蒸馏水漂洗一次。5.2.6吹于后，在普通光学显微镜下观察，判定结果。5.3结果判定
5.3.1在阴性血清对照、阳性血清对照成立的情况下：即阴性血清与正常细胞和病毒感染细胞反应均无色；阳性血清与正常细胞反应无色，与病毒感染细胞反应呈棕黄色至棕褐色，即可判定结果；否则应重试。
5.3.2待检血清与正常细胞和病毒感染细胞反应均呈无色，即可判为CIAV抗体阴性。3
NY/T 681—2003
5.3.3待检血清与正常细胞反应呈无色，而与病毒感染细胞反应呈棕黄色至棕褐色，即可判为CIAV抗体阳性。
综合判定
当在临床上怀疑有CIAV感染时，可根据实际情况在上述方法中选一种或两种方法进行确诊。对于未接种过CIA疫苗的鸡，采用任何一种方法检测呈现阳性结果时，都可最终判定为 CIAV感染鸡。对于接种过CIA疫苗的鸡，当病毒分离鉴定试验为阳性结果时，可最终判定为CIAV感染鸡；若仅血清学试验呈现阳性结果，应结合病史和疫苗接种史进行综合判定，不可律视为 CIAV感染鸡。4
A.1DMEM(高糖)培养液
附录A
（规范性附录）
试剂的配制
A.1.1量取去离子水950mL，置于适宜的容器中。A.1.2将DMEM粉剂10g加于30℃的去离子水中，边加边搅拌。A.1.3每1000mL培养液加3.7g碳酸氢钠。NY/T 681—2003
A.1.4加去离子水至1000mL,用1mol/L氢氧化钠或盐酸将培养液pH值调至pH6.9~～~7.0。在过滤之前应盖紧容器瓶塞。
A.1.5立即用孔径0.45μm的微孔滤膜正压过滤除菌，4℃冰箱保存备用。A.2磷酸盐缓冲液(PBS,0.01mol/LpH7.4）氯化钠
氯化钾
磷酸二氢钾
十二水磷酸氢二钠
蒸馏水
A.3洗涤液
吐温-20
A.4样品稀释液
含体积分数为10%新生牛血清的洗涤液。A.5磷酸盐-柠酸缓冲液（pH5.0）柠檬酸
十二水磷酸氢二钠
蒸馏水
A.6ELISA底物溶液
加至1000mL
1000mL
用二甲基亚砜将3'3'5'5'-四甲基联苯胺（TMB)配成1%质量浓度，4℃保存。使用时按下列配方配制底物溶液
磷酸盐-柠機酸缓冲液
1%3'3'5'5'-四甲基联苯胺
30%双氧水
NY/T 681--2003
终止液
氢氟酸
蒸馏水
免疫酶试验底物溶液
3,3-二胺基联苯胺盐酸盐（DAB）PBS
30%过氧化氢
滤纸过滤后使用，现用现配。
100 mL
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