【农业行业标准(NY)】 弓形虫病诊断技术

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中华人民共和国农业行业标准
NY/T573--2002
弓形虫病诊断技术
Diagnostic techniques for toxoplasmosis2002-08-27发布
中华人民共和国农业部
2002-12-01实施
NY/T573—2002
弓形虫病是由刚第弓形虫（toxoplasma gondii)引起的一种人畜共患寄生虫病。该病呈世界性分布，各种家畜，包括猪、牛，羊、犬、猫和实验动物，包括小白鼠、天竺鼠、家兔等，以及人类，都能感染弓形虫弓形虫病可使孕畜流产死胎，急性弓形虫病可造成家畜的死亡。得形虫感染孕妇后可引起流产，胎儿畸形或产出弱智儿。马形虫感染成人后，可侵害神经系统、呼吸系统、心脏、淋巴内皮系统等多种器官或系统，并造成损伤，严重时会造成死亡。因此，弓形虫病具有重要的公共卫生意义本标准由农业部畜牧兽医局提出。本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位：中国农业大学、中国农业科学院兰州兽医研究所。本标准主要起草人：汪明、杜重波、潘保良、刘群。572
1范围
弓形虫病诊断技术
本标准规定了弓形虫病的诊断技术要求。NY/T573--2002
本标准所规定弓形虫的分离鉴定适用于本病的确诊；间接血凝试验适用于大批量样品的普查。2弓形虫的分离鉴定
2.1材料准备
2.1.1器材：玻璃组织研钵，无菌砂子，5ml注射器及针头。2.1.20.8%生理盐水：加人青霉素和链霉素，使其终浓度分别为100ILl/ml.和10μg/ml.。2.1.3蛋白酶。
2.1.4健康实验小白鼠27只。
2.2待检样品的采集及处理
无菌采取病畜的脑组织、心、肝、肺、肾、骨骼肌各2g，以及3mL腹腔液，所取组织或器官材料分别放人玻璃组织研钵中，加人无菌砂子和0.8%的无菌盐水进行研磨，研磨成组织麋。研磨好的组织（器官），用0.8%的盐水配制成10%~20%的组织悬浮液。肺组织和肌肉组织悬浮液加入蛋白酶消化。消化后的组织愁浮液用于接种，腹腔液不用处理可直接接种。2.3操作方法
接种：选取27只健康试验用小白鼠，分为9组，每组3只，作如“下处理：空自对照组（1组）：不作任何处理；生理盐水接种组（1组）：每只小鼠腹腔接种生理盐水1mL；病料接种组（共7组）：每只小鼠分别腹腔接种2.2所制备的待检样品1ml。2.4检查与判定
小鼠接种待检样品后.如在2d14d内发生死亡，则应抽取腹腔渗出液涂片镜检。同时另采集脑、肝、肺、脾涂片，涂片进行姬姆萨染色后用显微镜镜检。若小鼠未发生死亡，则应在接种后的6～8周对小鼠进行捕杀，并按上述方法取样镜检。若在小鼠腹腔液中查出速殖子\或所取的组织样品中查出包囊？）或缓殖子\，则可将待检样品判为阳性。没有查出则判为阴性。尚空自对照组和生理盐水接种组没有查出弓形虫时，可进行结果判定，否则应重检。当所检样品中，有一个为阳性，即说明被检动物已被弓形虫感染，将其判为阳性；当所检样品全部为阴性时，将被检动物判为阴性。
1）速殖子量月芽形.长为4μm～8μm,宽为2μm~4μm~包囊呈球形.囊壁薄，真径为25 jm~100 μml。2）綫内往往充满圆形或月芽状的缓殖子，缓殖了长为3um.宽为2μm~3nl3）缓殖了对姬姆萨染液高度敏感，呈嗜碱性573
NY/T5732002
3间接血凝试验（IHA试验）
3.1材料准备
3.1.196(12×8)孔110°V形有机玻璃反应板，100μl.微量加样器，振荡器.医用离心机，移液管等。3.1.2形虫诊断制剂（IHA抗原），稀释液，阳性、阴性血清。3.2操作方法
3.2.1马形虫诊断制剂按瓶上标示毫升数加人灭菌蒸馏水稀释摇匀，1500r/min～2000r/min离心5min～10min，弃上清液，加等量稀释液摇勾，置4（下静置24h后使用。3.2.2采被检疫动物或人的血液2ml.~2.5ml.，分离血清（应无血球）。3.2.3用微量加样器往96孔有机玻璃反应板每孔加75μuI.稀释液。每个样品加4孔。每块板设阳性、阴性血清对照。对照均加8孔。
3.2.4往各红第1孔加25的被检血清，或阳性血清，或阴性Ⅲ清3.2.5用加样器对每组进行1：4系列稀释，被检血清组稀释至第3孔，阳、阴性对照组稀释至第7孔。被检血清组第4孔，阳、阴性对照组第8孔为稀释液（见表1）。表1
各组各孔的稀释度
被检面清组
阴性对照组
阳性对照组
（第·组）
稀释液对照
（另-组）
稀释液对照
稀释液对照
3.2.6将准备好的诊断液摇匀，用移液管加25μI.诊断液于每孔中。加完后将反应板置微型振荡器上振荡1min～2min，直至诊断液中的血球分布均匀，从振荡器上取下反应板，用干净的玻璃板或纸板盖住反应板，以防灰尘落人，置2237C静置2h～3h后观察结果。3.3判定
在阳性对照血清滴度不低于1：1024（第5孔）；阴性对照血清除第1孔充许存在前滞现象（+）外，其余各孔均为（-）；稀释液对照为（一)的前提下，对被检血清进行判定，否则应重做。闻接咖凝试验的判定标准如下：+十++”：100%红细胞在孔壁下部呈均质的膜样凝集。边缘整齐，致密。因重力关系，膜样凝集的红细胞有时出现下滑现象。
“十十十”：75%的红细胞在孔壁下部呈膜样凝集，不凝集的红细胞在孔底中央集中成很小的圆点。“++”：50%的红细胞在孔壁更下部呈稀疏的凝集，不凝集的红细胞在孔底中央集中成较大的圆点。
“十”：25%的红细胞在孔底凝集，其余不凝集的红细胞在孔底中央集中成大的圆点。””：所有的红细胞均不凝集，并集中于孔底中央呈规则的最大的圆点。被检血清第3孔（1：64稀释)达到^++”或以上，将被检样品判为阳性。被检血清第3孔（1：64稀释）为“十或一”,将被检样品判为阴性。374
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