【农业行业标准(NY)】 猪繁殖与呼吸综合症免疫酶试验方法

[CS 11.220
中华人民共和国农业行业标准
NY/T 679—2003
猪繁殖与呼吸综合症免疫酶试验方法Enzyme immunoassay for porcine reproductive and respiratory syndromc2003-07-30发布
中华人民共和国农业部bzxZ.net
2003-10-01实施
标准的附录A为规范性附录。
木标准出农业部畜牧兽医局提山并归口。本标准起草单位：农业部兽医诊断中心本标准十要起草人：王宏伟、土传彬、陈西钊、田克恭NY/T 679--2003
1范围
猪繁殖与呼吸综合症免疫酶试验方法本标准规定了猪繁殖与呼吸综合(PRRS)免疫腾试验和免疫酶纠纠化学方汰NY/T679-2003
标准适用于检测猪的清中的猪累殖与呼吸综食症柄毒（TRRSV)抗体和组织中的IRRSV范原2免疫酶试验
2.1材料准备
2.1.1试剂
2.1.1.1磷酸盐缓冲液（PB5)：制从笋A.章2.1.1.2抗原涂片的制备：1RRSV接神：上长个-80单层的Mtc-145细范，接种后3月4l.病变达50%75%时·用胰蛋门酶消化分敬感染的细跑单层-P35洗涤次后，稀释至1×10”个组跑m，取印有10个~40个小礼的室玻片，衔孔滴加1，宰温自然下爆后，冷内嗣（4%围定10 in,密位装.置一-20℃备。
2.1.1.3标准阳性血清：PRRSV试验感染猪制备的业清2. 1.1.4标准阴性而清：无IRRSV感染、末经统疫的猪血消2.1.1.5酵结个物：辣根过氧化物避（HRP)标证的前球菌A乐HS2. 1. 1. 6底物溶液配制见约 A. 2 章。2. 1.2器材
a）曾逆光学显微镜：
）有1个～0个小孔的空破片：
）微量加样器，穿最E-5CμI.：）37恒温培养箱或水浴箱。
2.1.3样品
采集被检猪血液分离血消，向清应新鲜、透明、大溶血、无污染，密装了灭哟小瓶山，或30保存或立文即送检。试验前将被检面游统·编，并叫作：1倍稀择。2.2操作方法
2.2.1取山抗原涤片，室温干燥后，滴加10倍稀释的补检息清和标准阴性的消标推雅阳性血清要宜清加调个脑毒细胞孔和--个正常细脏孔，置盒内.3min2.2.213s漂洗次每次5m.室源干燥：2.2.3满加适当筛释的嗨结合物.置湿盆内37~30min2.2.4PBS漂洗三次，4款5mn.
2.2.5将室玻片放入底物溶液中.室温下品血5min1imin。s漂洗两次·再用整，：2.2.6吹干后，在势迪光学品徽镜下规察判安结果。2.3结果判定
2.3.1在阴性直清对照阳性血清对照成的清况下：即附性虹清与正常细胞利病方“-泄跑反应均无色，阳性血清与正常细随反应无色，可病面感案维脆反应黑棕色至棕祸色，邮中差果：否则展董试。
2.3.2待检血清与正常细脑和病静感染细跑皮成均量无色，即可划为RSV抗生2.3.3得检血清与止常组脏反应量无色：间与病小感染临反应卡核准易色，部可判为1
NY/T 679—2003
PRRSV抗体阻性，
3免疫酶组织化学法
3.1材料准备
3.1.1试剂
3.1. 1.1磷酸盐缓冲液(PBS):配制第A.1 章3.1.1.2标准阳性血清：PRRSV实验感染猪制备的血清标准阴性血清:无PRRSV 感染、未经免疫的猪血清。3. 1. 1. 3
3.1.1.4酶结个物：HRP标记的SPA.3.1. 1. 5
5底物溶液：配制见第A.2章。
6过氧化氢甲醇溶液：配制见第A.3章。3. 1. 1. 6
盐拨酒精辫腋：配制见第A，1章，3. 1.1.7
3.1. 1.8鼠蛋色酶溶液:配制见第 A.5 章3.1.2器材
曾通光学显徽镜：
微量加样器，容量50μl-200ml；石蜡切片机或冷冻切片机：
1）载玻片及盖肢片：
37.温培养箱或水浴箱：
3.1.3样品
对疑似RRS的病死猪或扑杀猪：即采集肺、虚桃体和脾等组织数小块，置冰瓶内氵即送检。不能立即送检者，将组织块切成！cm义1cm左右大小留体积分数为1心的尔马林溶液中固定，保行送检
3.2操作方法
3.2.1新鲜组织按常规方法制备冰东划片：冰冻切片风下所旧丙解固定10min~15inm：新鲜组！或固定组织按常规方法制备蜡切片，常规脱蜡至PRS（切片应币白胶或铬码明胶做粘合剂，以防脱片），3.2.2去内源酶：用过氧化氢甲醇溶液或±酸酒精3作用20)min3.2.3胰蛋白酶消化：究温下，用战蛋白酶溶液消化处理2min，以厘充分象露抗原。漂洗:PRs漂洗三年次min，
3.2.5时闭：滴加体积分数为5%的新生牛血清或1：10稀释的止正赏马血清.37湿盒中作用30min3.2.6i适尚稀释的标准阳性而清或标推阴性血清.37%湿盒中作用1h或37：湿念中作旧30mit后4%过夜。
漂洗同 3.2.4。
3.2.8加适准稀释的酶结合物7（湿盒价用1h3. 2. 9漂洗同 3. 2. 4 ,
底物显色：新鲜配制的底物溶液显色jmin~10min后漂洗。3. 2. 10
3.2.11衬染;苏木索或中基绿村染细胞核或细胞质。3. 2. 12
从汇%乙醇始脱水，透明、封片、菩通光学显徽镜观察，试验同时设阳性刘照和阴性对照：3. 2. 13
3. 3结果判定
阳性和阴性对照片本底清晰，背景无非特异省染、阳性对照组织细泡地浆呈黄色至棕竭色着：三验成：被检组织细胞胞浆、偶见胞核早黄色至棕竭色着染，即可判为PRRSV抗原阳性、2
附录A
（规范性附录）
磷酸盐缓冲液(PBS,0.01moI/LpH7.4)氯化钠
氯化钾
磷酸二氢钾
十二水磷酸氨二钠
蒸馏水
底物溶液
3.3-—胺基联苯胺盐酸盐(T>AB)PI3S
30牙过氧化氧
滤纸过滤后使用，现用现配。
过氧化氢甲醇溶液（0.3%）
0%过氧化氢
现用现配。
盐酸酒精溶液（1%）
70%乙醇
胰蛋白酶溶液（0.5%）
胰蛋白酶
低温保存。使用时,用P13S稀释为0.05%，制
加至1000 mI,
100 nL
NY/T 679—2003
NY/T 679-2003
中华人民共动国农业
行业标准
猪繁殖与呼吸综合症免疫酶试验方法NY/T 879---2033
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