【农业行业标准(NY)】 猪伪狂犬病免疫酶试验方法

1cs11.220
中华人民共和国农业行业标准
NY/T678---2003
猪伪狂犬病免疫酶试验方法
Enzynmnc immunassay far porcinc pscudorabies2003-07-30发布
中华人民共和国农业部
2003-10-01实施
本标推的附录A是规范性附录。
本标准出农业部声牧兽医局提山并归口。本标准起草单位：农业部曾医诊断中心。本标雄主要起草人：王宏伟、吴清民，童光志、田克基、陈叫、源敬良、王传彬NY/T678—2003
猪伪狂犬病免疫酶试验方法
NY/T 678—2003
本标滩规定了猪伪狂犬病E糖蛋自gE,即PI酶联免疫吸附试验利免疫酶组织化学试验疗法本标推适用于检测猪而清中的猪伪狂犬病病毒F特异性抗体和组中的猪伪狂犬病病毒抗原2E糖蛋白酶联免疫吸附试验（gE-ELISA）2.1材料准备
2.1.1试剂
EIISA抗原包被板
bl标准阳性血清：伪征大病病毒gE单克隆抗体：标准阴性血清：无伪狂犬病病毒E抗体的猪血清酶结合物：球根过氧化物酶IIRP)标记的抗伪犯大病病E单克降抗体；磷酸盐缓冲液(PBS)：配制见第A.1章：洗涤液：配制见第A.2章；
样品稀释液：配制见第A3章；
h）底物溶液：配制见第A.5章，终比液：配制见第A.6章
2. 1.2器材
酶联检测仪：
h）微量加样器，容量50 μl.~-200 μl.:c）37℃恒溺培养箱。
2.1.3样品
采集被检猪血液，分离血清、血清应新鲜、透明、不溶血、无污染，密装丁火菌小瓶内、4℃或一30%.保存或文即送检，试验前将被检血清统一编号,并用样品稀释液作2倍稀释：2.2操作方法www.bzxz.net
2.2.1敢出包被板，拆将样品位置准确记录在记录单：2. 2.2间A：、A;、A，孔中分别加入100 μl. 末经稀释的阴性对赋血清，A：A：A：孔中分别加人100未经稀释的阳性对照血清，其他备孔翊人10{I稀释好的待整样品。2.2. 3 置率 1 h。
2.2.4弃去孔内液体，再在纱布或吸水纸1.拍十2.2.5用洗涤液将反应板洗涤(3～5)次.每次洗涤后均弃去能内液体。最后--次洗涤i,除扎15没体.下。
2.2.6每孔加人100 pL酶结合物溶液,室温下作用20 nin。2. 2. 7重复 2. 2. 4 和 2. 2. 5.2.2.8各加人100uL底物液
2. 2. 9室温放置 15 min，
2.2.10各礼加人50μl.整液，立即用酶标议于65Unm测定各孔吸光度（川）值2.3结果判定
2.3.1只有在阴性对照（OL)值的均值减去网性对照（）值的均值大于等了时.试验成。NY/T 678-—2003
2.3.2待检样品是否含有针对gF抗原的抗体取决下每个样品的S/N值，S/N等于样品OI值除以阴性对照1)均。
2.3.2.1妇果样品的SV值小于等于0.5.表明血清中含伪狂犬病病毒gE抗体。2.3.2.2如果S/N值人于0.6、小十等于0.7.应重新检测样品，如仍得到相同的结果，三周后应重新案样检测。
2.3.2.3如果S/N值人于0.7,表明血清中无gE抗体。3免疫酶组织化学法
3.1材料准备
3. 1. 1试剂
磷蔽盐缓冲液（FBS)：配制见第A「竞：u
b）标准相性血清：伪狂犬病病毒实验感染猪制备的血清；标准附性血清：无伪征犬病病寿燃染、未经免疫的猪血清：r）嗨结台物：IIRP标记的SIA：底物溶液：配制见第A，7章；
过氧化氟心醇溶液：配制第A.8章：盐校酒精溶液：配制见第A.9章：贼蛋自嗨落液：配制地第A.0章
3. 1. 2器材
通光学鼎微镜：
微样器，容尺5--2001
石切片机或冷冻划片桃：
载破片及益玻片：
\）37℃忙温培养箱或水浴箱。3.1.3样品
对疑伪打犬病的病死猪或扑系猪，立即采集肺、扇桃体和脑等组织数小块，置冰瓶内立即送检不能.立即送检者，将组织块切成1cm×1cm左右大小，置体积分数为10%的福尔马林溶液中固定，保存·送检。
3.2操作方法
3.2.1新鲜组织按常愿方法制备冰冻切片。冰冻切片风丁后用丙藏固定10min～15min；新鲜组织或固能红纠按常规方法制备有蜡划片，常规脱蜡至PBS（切片应用门胶或铬帆明胶做粘合剂.以防脱片），3.2.2去内源游：用过氙化氢甲醇溶液或盐酸酒精落藏37℃作用20min。3.2.3胰蛋门消化：弃温下，用肤蛋门酶溶液消化处理2tnin·以便充分暴露抗原，3.2.4漂洗：P13s漂洗二次，每次6min。3.2.5封洲：滴加体积分数为5%的新生牛血消或111C稀释的止常血清.37湿盒中作用30min。3.2.6加适当稀释的标准阳性而清或标准阴性血清，37℃湿盒中作用1h或37℃湿盒中作用30mit4过夜。
3.2.7漂洗间3.2.1,
3.2.8加适当稀释的嗨结合物.37℃湿盒作用1h。3.2.9漂洗尚3.2.4
3.2.10底物显包：新鲜配制的底物溶液显色5min10min后漂洗、3.2.11剂染：苏木索或甲基绿衬染细胞核或细胞质，3.2.12
2从%之醇开始脱水，透明、封片，普通光学显微镜观察，3试验同时设阳性对照和阴性对照。3.2. 13
3.3结果判定
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阳性和阴性对照片本底清晰，背景无非特异着染，阳性对照组织细胞胞核早黄色垒棕褐鱼着染、试验成立：被检组织细胞胞核、偶见胞浆呈黄色至棕褐色省染，即可判为伪狂犬病病毒抗原阳性3
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附录A
（规范性附录）
试剂的
磷酸盐缓冲液(PBS,0.01 mol/L pH7.4)氯化钠
氯化钾
磷醛二氨钾
十二水磷酸氢二钠
蒸馏水
洗涤液
叶湿20
样品稀释液
含体积分数为10%新生牛血清的洗涤液磷酸盐-柠檬酸缓冲液（pH5.0）A.4
柠檬酸
十二水磷酸氢二钠
蒸馏水
A.5gE-FLISA底物溶液
期至 1 ml
用二甲基亚砜将3'3'5'5°四甲基联苯胺（TMB)配成1不质最浓度，4℃保存。使用时按下列配片配制底物溶液，
磷酸盐-柠檬酸缓冲液
1%3'3'5'5'-四甲基联苯胺
30%双氧水
终止液
氨氟酸
蒸馏水
免疫酶组织化学底物溶液
3.3-二胺基联莱胺盐酸盐(1DAB)PBS
0. 31 rnl.
100 mL
30%过氧化氢
滤纸过滤后使用，现用现配。
过氧化氢甲醇溶液(0.3%)
31%过氧化氧
现用现配。
A,9盐酸酒精溶液(1%)
70%乙醇
胰蛋白酶溶液(0.5%）
胰蛋白酶
低温保存。使用时，用PBS稀释为0.05%。o.t ml.
NY/T 678—2003
NY/T 678-2003
中作人民共国农业
行业标滩
猪伪狂犬病免疫酶试验有法
NY/T 6$ 2003
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