【农业行业标准(NY)】 犬瘟热诊断技术

ICS.11.220
中华人民共和国农业行业标准
NY/T 684—2003
犬瘟热诊断技术
Diagnostic lechniues for canine distemper2003-07-30发布
中华人民共和国农业部
2003-10-01实施
本标难的附求A为规范性附录，
本标滩由农业部畜牧兽医局提出并归口。本标准起草单位：农业部兽医诊断中心。本标准主要起草人：田克恭、土宏伟、遇秀玲、陈西创、工传彬，NX/T 684--2003
1范围
犬瘟热诊断技术
NY/T 684—2003
本标准规定了犬瘟热(CD)的临床诊断、犬瘟热病毒(CDV)的分离与鉴定、免疫酶试验和免疫组织化学方法等诊断技术，
本标准适用于犬瘟热的诊断，
2临床诊断要点
2. 1 临床症状
（的临床表现多种彩样，与（IV的：环境茶件，宛主的年龄、粘种及免疫状态有差，病天伴温升高至0℃以上·奠流清说至脓性异汁.脓性眼屎，有咳嗽、呼吸急促等肺炎症状，腹下可见米粒大丘。病程长的犬足枕角质层增牛。病泻期CDV侵害大脑时则出现神经症状,头，颈、四肢抽搐。2.2病理变化
（DV为泛嗜性病毒,对上皮细胞有特殊的亲和力-因此病变分布非常广泛。新生幼火感染CIV通常表现胸腺萎缩。成年犬多表现结膜炎、鼻炎、t管支气管炎利卡他性肠炎。表现神经症状的大通管可见另利脚垫的皮肤角化病，中枢神经系统的大体病变包括脑膜充血，脑空扩张和因脑水肿所致的脑脊液增加。
(CD的包涵体通常呈嗜酸性，位丁胞浆内，白径1m～5um.可在粘膜上皮细胞，网状细胞，亢细胞、神经胶质细驱和神经儿中发现。核内他涵体多位于被覆上皮细胞、腺上皮细胞和神经节细胞。3病毒分商与鉴定
3.1材料准备
3.1.1试剂
3. 1.1. 1改良最低要素营养液(DMEM)培养基、配方见第 A. 1 章,3. 1.1.2非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)。3.1.1.3标推阳性血清:CDV单克隆抗体，中和抗体效价1：1021，3. 1. 1. 4标推阴性血清：无DV感染的犬血清。3. 1. 1. 5 新生生血清处理:用尤血清 DMFM 洗涤细胞网次,加[人培养液一分之一量的新牛:牛血言87%吸谢h。吸附后的新生牛迦清分装，置一29℃备用。3.1.1.6青霉素、链莓索。
3. 1.2器材
a）细胞培养瓶：
吸管；
一氧化碳培养箱；www.bzxz.net
37'℃.恒溢水浴箱
普通冰箱及低温冰箱；
离心机及离心答：
研磨器械；
普通光学显微镜：
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微量加样器，容量5μ～50μl,50μ~-200ml.;j）0.45um微孔滤膜。
3.1.3样品
CT)V存在于病火心脏、肺脏、脾脏、胸腺、淋巴结等组织器官中。无菌采集这些器官用无立清DMEM制成20环组织感液，3000r/min离心30min.取[消。I000r/min离心20min,取:清用于CDV分离
3.2操作方法
3.2.1细胞培养
用含8影已处埋的新生牛血清的DMEM培养禁：在37%培养Vero细胞，每3d-~4传代--次，细胞长成单层时.用于CDV分离。3. 2. 2 病料接种
将0：mL处现好的组织悬液接种Vero细胞，33℃吸附1h.加人光血清DMEM继续培养5d~7d.观察果.
3.2.3结果观察
Ci)感染Vero细胞4 d-~5d衣现为细胞变圆、胞浆内题粒变性和穿泡形成，随后形成巨细胞和合跑体，并在购浆中出现包涵体。若第一次接种未出现细胞病变，成将细胞培养物冻融后自传三代。如仍无细脑病变,则判为CDV 检测阴性。3.2.4CIV的鉴定
将出现细胞病变的细胞跑培养物，按第4章的力法制备细胞涂片，用（I)V单克抗体进行鉴定。4免疫酶试验
4.1材料准备
4.1.1试剂
4. 1.1. 1磷酸盐缓冲液(PRS),配制见第 A.2章。4.1.1.2抗原涂片的制备：将CDV接种Vcro细胞，接种后5~7d，病变达50%~75%时，用胰蛋门酶消化分散感染细胞,PBS洗涤三次后,稀群至1× 10″个细胞/ti1.取卵有 10 个--40 个小孔的室玻片.每孔滴讯10μL。室温自然于燥后，冷闪酮(4℃）固定10min，密封包装·置一20℃备用。4.1.1.3标准性而清：CDV单克隆抗体，中利抗体效价1：10244.1.1.4标准阴性血清：无CIV感染的犬血清，4.1.1.5酶结介物：HRI标记的葡萄球菌A蛋白普光学品微镜：
印有10个~40个小孔的室玻片；
c）微童加样器.容录 5 μI -~50 μL;d）37℃忆温增养箱或水浴箱。
4.1.3样品
来集被检犬血液·分离血清，血清应新鲜、透明、不血、无污染，密装于灭菌小瓶内，4七或一存或立即送检，或验前将被检血清统一编号.并用PBS作10信稀释。4.2操作方法
4.2.1出抗原涂片空温十煤后，滴加10倍稀释的待检血清和标准防性血清、标准阳性兰：力·三分血消两个病毒细胞孔和个正常细胞孔，置湿盒内，37%.30min4.2.2PB5漂洗三次，每次5min，室温1燥。4.2.3滴加适当稀释的酶结合物，置湿盒内.37。30min。4.2.4PBS漂洗次，每次5rnin。
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4.2.5将室玻片放人底物溶液中室温下显色！min~1min。PBS漂洗两次.用蒸馏水漂洗次.4.2.6吹十后在普通光学显微镜下观察，判定结果。4.3结果判定
4.3.1在阳性血清对照、阳性血清对照成立的情况下：印阴性清与正常细胞和病毒感染维胸反高均无色：阳性血清与止常细胞反应无色与病毒感染细胞反应棕英色至棕褐色，邸可判定结果：否则座重试，
4.3.2待检业清与正常细胞和病毒感染细胞反应均呈无色.即可判为CDV抗体阴性4.3.3待检血清与正常细胞反成呈无色，而与病毒感染纠跑反成是棕黄他系棕祸色，即用判为（T产沐可。
5免疫酶组织化学法
5.1材料准备
5. 1. 1 试剂
磷酸盐缓冲液(PJ3S):配糊见第 A. 1章。6)
标准阳性血清：CDV单克降抗体，中和抗体效价1：：024标准阴性血清：无CDV感染的大血清孵结合物：HRP标记的SPA。
过氧化氨中醇溶：配制见第A.1章。盐酸酒精溶液：配制见第 A.5 章，胰蛋白酶溶液：配制见第A,5 章。g
底物辫液：配制见第A.3章。
5.1.2器材
苔道光学显微镜：
微量加样器，容量l~200：
石蜡切片机或冷冻切片机；
载玻片及盖玻片：
e）37%恒温培养箱或水浴箱。
5.1.3样品
对疑似（I)V的病死犬或扑杀犬，文即采集肺、脾、胸腺、淋巴结和脑等组织数小块，置冰瓶内7串送检。不能立即送检者，将组织块切成1cm×1cm左右大小，背体积分数为10%的福尔马林落液F需定，保存，送检。
5.2操作方法
5.2.1新鲜组织按常规方法制备冻切片冰冻切片风干后用内酮固定10min-~15trin：新丝我制定组织按常规方法制备个蜡划片，常现脱蜡个P13S(切片应用白胶或矾明胶做粘合剂.\一5.2.2么内源酶：用过氧化氢甲醇游液或盐酸酒精溶液37（.作用2tmml5.2.3胰蛋自酶消化：溢下用映蛋白酶溶液消化处埋2mi，以便充分案露抗原5.2.4漂洗：PRs漂洗兰次，每次5min。5.2.5封闭：滴加体积分数为5岁的新牛牛而消或1：10稀释的T常马血清3盒=一，im5.2.6E运当稀释的标准组性血消或标准阴性血清，7%，湿盒中件用1：或：-”\准mim4%过夜。
5.2.7漂洗回5.2.4
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5.2.8适当臻释的结合物.37℃盒作用ih，5.2.9漂洗间5.2.4
5.2.10底物显色：新配制的底物溶液显他5min～10min质漂洗：5.2.11衬染：苏木素或甲基绿衬染细胞核或绷胞质。5.2.12从90%艺醇开始脱水、透明、时片、通光学显微镜观察5.2.13试验同时设陷性对照和阴性对照。5.3结果判定
性和阴性对照片本底清晰，背筑无非特异着染，阳性双照组织纠跑跑浆量黄色至棕谢色尊染，试睑成：被捡纠织细脆胞胞浆、偶见胆核星色全棕满色着染即巾判为（抗凉阳性，综合判定
当个临床上怀疑勺（W感染时，可根堰实际情况在1遂方法中述·种或两科方法行确诊：对于未接种过（IW疫苗的大.采用任何种方法检测里现限.性结果.部川最终判先为（.DV感染大，对于接种过（IV疫节的人，当病毒分离鉴症战验为阳性结果时，川最终判定为（IV感染大;者仅血清学试验冶现阳性结某·应邹合病史和接接称史逃行综合判定，不间-律视为（W悠染犬：4
A.1DMEM(高糖)培养液的配制
附录A
【规范性附录】
试剂的配制
A. 1. 1昂取去离了水 950 mL.置寸适亢的容幕，A.1.2将DMEM粉剂10加于30%的去离可水中边照动模押。A.1.3每10mE培养液加 3.7g碳酸急铜：NY/T 684—2003
A.1.4加去离了水至100cmI.1o/1.氢氧化钠或盐酸将培养液H值调至pl16.9--7.0。在过滤之前应盖紧容器瓶寒：
A.1.5立即而孔径C.15um的微孔滤膜正而过滤除案.1Y.冰箱保存各用。A.2磷酸盐缓冲液(PBS,0.01 mnol/LpH7.4)氯化钠
氯化钾
磷酸一氢钾
1二水磷酸氮二钠
蒸淄水
A.3底物溶液
3.3·二胺基联苯胺盐酸盐（DAB)PBS
31为过鼠化氧
纸过滤后使用，现用现配。
A.4过氧化氢甲醇溶液（0.3%）
30%过氧化氢
现用现配。
盐酸酒精溶液（1%）
73%乙醇
A. 6胰蛋白酶溶液(0.5%)
峨蛋白酶
前至1 (0 ml
低温保存，德用时·用PS烯释为F5
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宁激12「
20年：11川第-阪2003年1月第次印1
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