【农业行业标准(NY)】 禽白血病病毒p27抗原酶联免疫吸附试验方法

TCS11.220
中华人民共和国农业行业标准
NY/T680—2003
禽白血病病毒p27抗原
酶联免疫吸附试验方法
Enzyme-linked immunosorbent assayfor avian leukosis virus p27 antigen2003-07-30 发布
中华人民共和国农业部
2003-10-31实证www.bzxz.net
本标准的附录A为现范性附录：
本标雄山农业部畜牧兽医局提出并归口。木标准起草单位：农业部兽医诊断中心，木标滩主要起草人：陈四钊、办破良、十宏伟、用克恭、吴清民、王传彬NY/T 680—2CE3
1范围
禽白血病病毒p27抗原
酶联免疫吸附试验方法
本标准规定了禽血病猴毒（ALV)p27抗原酶联免疫吸附试验方法。本标雅适用于检测鸡蛋蛋清以及鸡还纠细范培养物中的A1.Vp27蛋H抗原。2p27抗原酶联免疫吸附试验
2.1试验材料
2. 1. 1 试剂
NY/T680-2033
2.1.1.1抗?27蛋门抗体：应用提纯的成髓组胞性白血病病带r27蛋白免疫家免制备2.1.1.2阳性抗原：含鸡H血病/肉瘤病毒群特异性p27蛋白抗娠的鸡清。2.1.1.3阴性抗原：无鸡广血病/肉瘤病毒群异性[27带白抗原的SF鸡蛋清。2.1.1.4嗨结合物：辣根过氨化物酶标记的抗27蛋白抗件。2.1.1.5磷酸盘缓冲液（P13S)：配制见第A,1章，2. 1、1. 6包被液:配削第 A, 2 章。洗涤液：配制见第 A.3 竞。
2. 1. 1. 7
2.1.1.8栏品稀释液：配制见第A.1章。2. 1. 1. 9
底物浒液：配制见第A,6章。
2. 1. 1. 10
终止液：配制见第A.7章，
酶联检测仪；
聚米乙烯板：
微量加栏器，容量50200：
（）37℃帆温培养箱。
2、1.3样品
2. 1. 3. 1
鸡蛋烊品：将待检鸡蛋小的端朝「改雪.打碎蛋壳.用移液器光菌吸以蛋清：密装于灭菌小凝内。
组胞音养物：用移波器无菌吸取细胞培养物，密装十火菌小瓶内，1或30飞保存或立品2. 1. 3. 2
检，就验前将送检样品统编号，减验时不做稀释。2.2操作方法
2.2.1用包被液将抗p27蛋白抗体作400℃倍稀释.每孔0.加人9孔聚米乙烯板f.2.2.2取出包被好的聚举乙烯板，将液体倒郑，每孔加250川.洗条液漂洗=次，每次2.--2.2.3每孔150μL质量浓度为1%的明胶封闭疫.37℃反应60zmim2. 2. 4复 2. 2. 2 .
2.2.5在AA：几各加100L.标准性对照，A，A，孔各加1COuL你准阳：性对2.2.6将待检栏品人其他各孔，每个待检样本圳两孔，每孔130u，37%反成-·2.2.7车复2.2.2
2.2.8每孔加10011作浓度的辣极过氧化物记的范27张自护体.3：，mnNY/T 680—2003
9重复2.2.2,
2.2.10每孔加100l.新配制的底物溶液，室温，避光反应10 minr2.2.11每孔10μ.终止液
2.2.12置酶联检测仪于450 nm测定各孔吸光度(0)值。2. 3结果判定
2.3.1阴性对照OD均值等于（A，孔OT值+A孔I）值)/2：阳性对照(D均值等于（A值+A4孔值)/2。
2. 3. 2阴性对照 (01)均值小于 0. 15,阳性对照 01)均值减么所性对照 1)均值大于 0. 3时试验成三否则重做。
2.3.39/P等丁（样品孔（OD均值一阴性对照（D均值）（阳对照OD均值阴偿对照D均值）待检样本 S/P小丁等于 (. 2判为阴性，表示待检样品中无 ALVs p27蛋户抗原。待检样木 S/ F 大T 0. 2 判为阳性,表示待检样品中有 AI.Vs P27 蛋白抗原。附录4
（规范性附录）
试剂的配制
A. 1磷酸盐缓冲液(PBS,0.01 moI/L pH7. 4)氯化
氯化钾
磷酸二氢钾
十二水磷酸氢二钠
蒸馏水
包被液(0.05mml/L.pH9,6)
碳酸钠
蕨酸氢钠
蒸馏水
洗涤液
T'wecn 2℃
A.4样品稀释液
含体积分数！0%新生牛血清的洗涤液。磷酸盐-柠酸缓冲液（p15.0）
柠檬酸
十二水磷酸氨二钠
蒸馏水
底物溶液
加至「000 mL
加至1000ml
NY/T 680—2003
用二甲基砜将3°355-四巾基联苯胺（TM13）配成1为的浓度，4℃保行，使用时按下列配方西*底物溶液。
磷酸盐-栏磁酸缓冲液
1※3'3'5\5'-四甲基联苯胺
30双氧水
终止液
蒸馏水
NY/T 6B0-2003
中华人民共和国农业
行业标准
禽白血病病毒p27抗原
酶联免疫吸附试验方法
NY/T 686 - 2003
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