【国家标准(GB)】 化妆品微生物标准检验方法 粪大肠菌群

中华人民共和国国家标准
化妆品微生物标准检验方法
粪大肠菌
Standard methods of microbiologicalexamination for cosmetics
Fecal coliforms
UDC 668.58 : 576
.85.07
GB7918.3-87
粪大肠菌群细菌来源于人和温血动物的粪便。检出粪大肠菌群表明该化妆品已被粪便污染，有可能存在其他肠道致病菌或寄生虫等病原体的危险。因此粪大肠菌被列为重要的卫生指标菌。1方法提要
根据粪大肠菌群所具有的生物特性，如革兰氏阴性无芽胞杆菌在44℃培养24～48h能发酵乳糖产酸并产气，能在选择性培养基上产生典型菌落，能分解色氨酸产生髋基质。2 培养基和试剂
2.1乳糖胆盐培养基
成分：蛋白陈
猪胆盐
0.4%溴甲酚紫水溶液
蒸馏水
1000ml
制法：将蛋白陈、胆盐及乳糖溶于蒸馏水中，调pH到7.4，加入指示剂，混匀，分装试管（每支试管中加—个小倒管）。115℃（101b)20min灭菌。2.2双倍浓度乳糖胆盐培养基
按上述乳糖胆盐培养基成分，蒸馏水量不变，其他成分量加倍。2.3伊红美蓝(EMB)琼脂
成分：蛋白陈
磷酸氢二钾
2%伊红水溶液
0.5%美蓝水溶液
蒸馏水
1000ml
制法：先将琼脂加到900ml蒸馏水中，加热溶解，然后加入磷酸氢二钾蛋白陈，混勾，使之溶解。再以蒸馏水补足至1000ml。校正pH值为7.2～7.4，分装于烧瓶内，121℃（151b）15min高压灭菌备用。临用时加入乳糖并加热融化琼脂。冷至60℃左右以无菌手续加入灭菌的伊红美蓝溶液，摇匀。倾注平血备用。
中华人民共和国卫生部1987-05-28批准140
1987-10-01实施
2.4蛋白陈水（作靛基质试验用）成分：蛋白陈(或胰蛋白陈)
氯化钠
蒸馏水
GB7918.3—87
1000ml
制法：将上述成分加热熔化，调pH值为7.0～7.2,分装小试管，高压灭菌121℃(151b)15min。2.5靛基质试剂www.bzxz.net
柯凡克试剂：将5g对二甲氨基苯甲醛溶解于75ml戊醇中,然后缓慢加入浓盐酸25ml。试验方法：接种细菌于蛋白陈水中，于44℃培养24h。沿管壁加柯凡克试剂0.3～0.5ml，轻摇试管。阳性者于试剂层显深玫瑰红色。注：蛋白陈应含有丰富的色氨酸，每批蛋白陈买来后，应先用已知菌种鉴定后方可使用。2.6革兰氏染色法
2.6.1染液制备
2.6.1.1结晶紫染色液：
结晶紫
95%酒精
1%草酸铵水溶液
将结晶紫溶于酒精中，然后与草酸铵溶液混合。2.6.1.2革兰氏碘液：
碘化钾
蒸馏水
将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300ml。2.6.1.3脱色液：95%乙醇。
2.6.1.4复染液：
沙黄复染液：
95%酒精
蒸馏水
将沙黄溶解于酒精中，然后用蒸馏水稀释。b.
稀石碳酸复红液：称取碱性复红10g，研细，加95%乙醇100ml，放置过夜，滤纸过滤。取该液10ml，加5%石碳酸水溶液90ml混合，即为石碳酸复红液。再取此液10ml加水90ml，即为稀石碳酸复红液。
2.6.2染色法
将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染1min，水洗。2. 6.2.1
2.6.2.2滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗。2.6.2.3滴加95%酒精脱色，约30s，或将酒精滴满整个涂片，立即倾去，再用酒精滴满整个涂片，脱色10s，水洗。
2.6.2.4滴加复染液，复染1min，水洗，待干，镜检。2.6.3染色结果
革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。注：如用1：10稀释石碳酸复红染色液作复染液,复染时间仅需10s。3仪器
3.1恒温水浴或隔水式恒温箱：44℃。141
温度计。
3.3显微镜。
载玻片。
3.5接种环。
3.6电炉。
锥形瓶。
3.8试管。
小倒管。
pH计或pH试纸。
高压消毒锅。
灭菌吸管。
灭菌平皿。
4揉作步骤
GB 7918. 3 -- 87
4.1取10ml1：10稀释的样品，加到10ml双倍浓度的乳糖胆盐培养基中，置44℃培养箱中培养24～48h，如不产酸也不产气，则报告为粪大肠菌群阴性。4.2如产酸产气，划线接种到伊红美蓝琼脂平板上，置37℃培养18～24h。同时取该培养液1～2滴接种到蛋白陈水中，置44℃培养24h。经培养后，在上述平板上观察有无典型菌落生长。大肠菌群在伊红美蓝琼脂培养基上的典型菌落呈深紫黑色，圆形，边缘整齐，表面光滑湿润，常具有金属光泽。也有的呈紫黑色，不带或略带金属光泽，或粉紫色，中心较深的菌落。亦常为大肠菌群，均应注意挑选。4.3挑取上述可疑菌落，涂片作革兰氏染色镜检。4.4在蛋白陈水培养液中，加入靛基质试剂约0.5ml，观察靛基质反应。阳性者液面呈玫瑰红色，阴性反应液面呈试剂本色。
5检验结果报告
平板上有典型菌落，并经证实为革兰氏阴性短杆菌，靛基质试验阳性，则可报告被检样品中检出粪大肠菌群。
附加说明：
本标准由中国预防医学科学院环境卫生监测所归口。本标由“化妆品微生物标准检验方法”起草小组起草。本标准主要起草人周淑玉。
本标准由中国预防医学科学院环境卫生监测所负责解释。142
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