【国家标准(GB)】 化妆品微生物标准检验方法 绿脓杆菌

中华人民共和国国家标准
化妆品微生物标准检验方法
Standard methods of microbiologicalexamination for cosmetics
Pseudomonas aeruginosa
UDC 668.58 : 576
.85.07
GB 7918. 4-87
绿脓杆菌在自然界分布甚广，空气、水、土壤中均有存在。对人有致病力，常引起人皮肤化脓感染，特别是烧伤、烫伤、眼部疾病患者被感染后，常使病情恶化，并可引起败血症，因此，在化妆品卫生标准中规定不得检出绿脓杆菌。
1方法提要
根据本菌生物学特征：革兰氏阴性杆菌，氧化酶阳性，能产生绿脓菌素。此外还能液化明胶，还原硝酸盐为亚硝酸盐，在42℃条件下生长等，可与类似菌相区别。2培养基和试剂
2.1SCDLP液体培养基
见GB7918.1—87《化妆品微生物标准检验方法总则》。
2.2十六烷三甲基溴化铵培养基
成分：牛肉膏
蛋白陈
氯化钠
十六烷三甲基溴化铵
蒸馏水
1000ml
制法：除琼脂外，将上述成分混合加热溶解，调pH为7.4～7.6，加入琼脂，115℃（101b）20min灭菌后，制成平板备用。
2.3乙酰胺培养基
成分：乙酰胺
氯化钠
无水磷酸氢二钾
无水磷酸二氢钾
硫酸镁（MgSO.·7H,O)
蒸馏水
1000ml
制法：除琼脂和酚红外，将其他成分加到蒸馏水中，加热溶解，调pH为7.2，加入琼脂、酚红，121C中华人民共和国卫生部1987-05-28批准1987-10-01实施
GB7918.4-87
（151b）20min高压灭菌后，制成平板备用。2.4绿脓菌色素测定用培养基
成分：蛋白陈
氯化镁
硫酸钾
甘油（化学纯）
蒸馏水
1000ml
制法：将蛋白陈、氯化镁和硫酸钾加到蒸馏水中，加温使溶解，调pH至7.4，加入琼脂和甘油，加热溶解，分装于试管内，115℃(101b)20min高压灭菌后，制成斜面备用。2.5明胶培养基
成分：牛肉膏
蛋白陈
蒸馏水
1000ml
制法：取各成分加在蒸水中浸泡20min，随时搅拌加温使溶解，调pH至7.4，分装于试管内，经115℃101b）20min灭菌后，直立制成高层备用。2.6硝酸盐蛋白陈水培养基
成分：蛋白陈
酵母没膏
硝酸钾
亚硝酸钠
蒸馏水
1000ml
制法：将蛋白陈和酵母浸膏加到蒸馏水中，加温使溶解，调pH为7.2，煮沸过滤后补足液量，加入硝酸钾和亚硝酸钠，溶解混匀，分装到加有小倒管的试管中,115℃(10 1b)20 min灭菌后备用。2.7普通琼脂斜面培养基
成分：蛋白陈
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氟化钠
蒸馏水
1000mi
制法：除琼脂外，将其余成分溶解于蒸馏水中，调pH为7.2～7.4，加入琼脂、加热溶解，分装试管，121℃（151b)15min高压灭菌后，制成斜面备用。3仪器
3.1培养箱：37℃、42℃。
3.2锥形烧瓶。
3.3试管。
3.4灭菌平Ⅲ。
3.5灭菌刻度吸管。
3.6显微镜。
3.7载玻片。
3.8接种针、接种环。
3.9电炉。
3.10高压消毒锅。
4操作步骤
GB7918.4—87
4.1增菌培养：取1：10样品稀释液10ml加到90mlSCDLP液体培养基中，置37℃培养18～24h。如有绿脓杆菌生长，培养液表面多有一层薄菌膜，培养液常呈黄绿色或蓝绿色。注：如无SCDLP液体培养基时，可用普通肉汤培养基。检验含防腐剂的化妆品时，在每1000mI普通肉汤中加1g卵磷脂、7g吐温80。
4.2分离培养：从培养液的薄菌膜处挑取培养物，划线接种在十六烷三甲基溴化铵琼脂平板上，置37℃培养1824h。凡绿脓杆菌在此培养基上，其菌落扁平无定型，向周边扩散或略有蔓延，表面湿润，菌落呈灰白色，菌落周围培养基常扩散有水溶性色素，此培养基选择性强，大肠艾希氏菌不能生长，革兰氏阳性菌生长较差。
在缺乏十六烷三甲基溴化铵琼脂时也可用乙酰胺培养基进行分离，将菌液划线接种于平Ⅲ中，放37℃培养24h，绿脓杆菌在此培养基上生长良好，菌落扁平，边缘不整，菌落周围培养基略带粉红色，其他菌不生长。
4.3染色镜检：挑取可疑的菌落，涂片，革兰氏染色，镜检为革兰氏阴性者应进行氧化酶试验。4.4氧化酶试验：取一小块洁净的白色滤纸片放在灭菌平皿内，用无菌玻璃棒挑取绿脓杆菌可疑菌落涂在滤纸片上，然后在其上滴加一滴新配制的1%二甲基对苯二胺试液，在15~30s之内，出现粉红色或紫红色时，为氧化酶试验阳性，若培养物不变色，氧化酶试验阴性。4.5绿脓菌素试验：取可疑菌落2~3个，分别接种在绿脓菌素测定用培养基上，置37℃培养24h，加入氯仿3～5ml，充分振荡使培养物中的绿脓菌素溶解于氟仿液内，待氯仿提取液呈蓝色时，用吸管将氯仿移到另一试管中并加入1N的盐酸1ml左右，振荡后，静置片刻。如上层盐酸液内出现粉红色到紫红色时为阳性，表示被检物中有绿脓菌素存在。4.6硝酸盐还原产气试验：挑取被检的纯培养物，接种在硝酸盐陈水培养基中，置37℃培养24h，观察结果。凡在硝酸盐陈水培养基内的小倒管中有气体者，即为阳性，表明该菌能还原硝酸盐，并将亚硝酸盐分解产生氮气。
4.7明胶液化试验，取绿脓杆菌可疑菌落的纯培养物，穿刺接种在明胶培养基内，置37℃培养24h，取出放冰箱10～30min，如仍呈溶解状时即为明胶液化试验阳性，如凝固不溶者为阴性。4.842℃生长试验：挑取纯培养物，接种在普通琼脂斜面培养基上，放在41～42℃培养箱中，培养24～48h，绿脓杆菌能生长，为阳性，而近似的荧光假单胞菌则不能生长。5检验结果报告
被检样品经增菌分离培养后，经证实为革兰氏阴性杆菌，氧化酶及绿脓菌素试验皆为阳性者，即可报告被检样品中检出有绿脓杆菌。如绿脓菌素试验阴性而液化明胶、硝酸盐还原产气和42C生长试验三者皆为阳性时，仍可报告被检样品中有绿脓杆菌。附加说明：
本标准由中国预防医学科学院环境卫生监测所归口。本标准由“化妆品微生物标准检验方法”起草小组起草。本标准主要起草人周淑玉。
本标准由中国预防医学科学院环境卫生监测所负责解释。145
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