【国家标准(GB)】 化妆品微生物标准检验方法 总则

中华人民共和国国家标准
化妆品微生物标准检验方法
Standard methuds of microbiologicalexamination for cosmietics
General rules
1样品的采集及注意率项
UDC 668. 58 : 576
GB7918.1-87
1.1所采集的样品，应具有代表性，一般视每批化妆品数量大小，随机抽取相应数量的包装单位。检验时，应分别从两个包装单位以上的样品中共敢10g或10ml。包装量小的样品，取样量可酌减。1.2供检样品，应严格保持原有的包装状态。容器不应有破裂，在检验前不得启开，以防再污染。1.3接到样品后，应立即登记，编写检验序号，并按检验要求尽快检验，如不能及时捡验，样品应放在掌温阴凉干燥处不要冷或拎冻。1.4只有一个样品面同时需做多种分析，如细菌，毒理、化学等，则宜先取出部分样品作细菌检验：再将剩余样品作其他分析。
1.5在检验过程中，从开封到全部检验操作结束，均须防止微生物的再污染和扩散，所用器Ⅲ及材料均应事先灭菌，金部操作应在无菌室内进行。或在相应条件下，按无菌操作规定进行。1.6如检出粪大肠菌群或其他致病菌，白报告发出起该菌种及被检样品应保存一个月备查。2供检样品的制备
2.1培养基和试剂
2.7.1生理盐水
氟化钠
蒸馏水
1000ml
溶解后，分装到玻璃珠的锥形瓶内，每瓶90ml,121C(15lb)20min高压灭菌。2. 1.2SCDLP 液体培养基
成分：酪蛋白陈
大豆蛋白陈
氯化钠
磷酸氢二钾
葡萄瓣
卵磷脂
吐温80
蒸馏水
1000ml
制法，将上述成分混合后，加热溶解，调pH为7.2～7.3分装，121℃（151b）20min高压灭菌。注意振荡，使沉淀于底层的吐温80充分混合，冷却至25℃左右使用。中华人民共和国卫生部1987-05-28批准网友交流资料
1987-10-01实施
GB 7918.1-87
注:如无酪蛋白陈和大否蛋白陈，也可用日本多陈代势。2.1.3灭菌液体石蜡。
2. 1. 4灭菌吐温 80。
2.2仪器
2.2.1天平。
2.2.2灭菌锥形瓶：内含玻璃珠及90ml稀释液。2.2.3灭菌刻度吸管，10ml,5ml。2.2.4水裕箱。
2.2.5灭菌研钵皮灭菌研棒。
2.2.6均质器。
2.3不同类型样品的检样制备
2.3.1液体样品
2. 3. 1. 1水溶性的液体样品，可量取10ml 加到 90ml 灭菌生理盐水中，如样品少于10ml。仍按 10倍稀释法进行。如为 5ml卿如45ml灭菌生理盐水，混匀后,制成110稀释液。2.3.1.2油性液体。取样品10ml，先加5ml灭菌液体石蜡混勾，再加10ml灭菌的吐温80，剂40~44℃水浴中振荡混合 10min，加入灭菌的生理盐水75ml（在10~～41℃水浴中预温),在40～11℃水浴中乳化，制成110的悬液。
2.3.2膏、霜、乳剂平固体状样品2.3.2.1亲水性的样品，称取10g，加到灭菌的带玻璃珠加有 90ml灭菌生印!盐水的锥形瓶中，充分振荡混，放32℃水浴静置15min。用其上清作为1110的稀释液。2.3.2.2毓水性的样品，称取10g，放到灭菌的研钵中，加10ml灭菌液体石蜡，研磨成粘稠状，再加10ml灭菌吐温80，研磨待溶解后，加70ml灭菌生理盐水，在40～41℃水浴中充分混合，制成1：10稀释液。
2.3.2.3固体样品，称取10g，加到灭菌的生理盐水稀释瓶中，振荡句，使其分散混悬后，放30~32℃水浴中，15min后取山，充分振荡泥合，再放到30~32℃水浴中静置15min，收上清液作为1：10的稀释液。
如有均质器，上述水溶性膏、霜、粉剂等，可称10g样品加90ml灭菌生理盐水，均质1～2mn，疏水性，箱及眉笔、口红等，称1呢样品加90mlSCDLP液体培养基，惑18样品如1ml灭菌液休石蜡，1m灭菌吐温80.7ml灭菌生理盐水，均质3～~5min，附加说明：
本标雅由中国预防医学科学院环境卫生监测所归口。本标准由“化妆品微生物标准检方法”起小组起草。本标雅主要起草人周撤下。
本标准出中国预防医学科学院环境卫生蓝测所负贵解释。中华人民共和国国家标准
化妆品徽生物标准检验方法
细菌总数测定
Standard methods of microbiologicalexatninatinn for cnsnetics
Standard platecount
UDC 668. 58 : 576
.85.07
GB 7918. 2:—87
细菌总数系指1或1ml化妆品中所含的活菌数量，测定细菌总数可用来判明化妆品被细菌污染的程度，以及生产单位所用的原料、工具设备、工艺流释、操作者的卫生状况，是对化妆品进行卫生学评价的综合依据。
本标准采用标准平板让数法。
1方法提要
化妆品中污染的细菌种类不同，每种细菌都有它·定的生理特性，培养时对營养要求，培养温度，培养时间、pH值、需氧性质等均有所不同。在实际工作中，不可能做到满足所有菌的要求，因此所测定的结果：只包括在本方法所使用的条件下（在卵磷脂、吐温80营养琼脂上，于37培养18h）生长的-群嗜中温的需氧及兼性庆氧的细菌总数。2培养基和试剂
2.1生理盐水：见行B7918.1—87《化妆品微生物标准检验方法总则》
2.2卵磷脂、吐温80-骨养琼脂培养基成分：蛋白陈
氯化钠
卵磷脂
吐温80
1000ml
制法：先将卵磷脂加到少蒸癣水中，加热溶解，加入吐溢80將基他成分（除琼脂外)加到其余的蒸馏水中，溶解。珈入已溶解的卵磷脂、吐温80，混勺，调pH值为7.1～7.1，加入琼脂，121C（15Ih)20 min 离玉火菌,储存于冷暗处备用。3仪器
3.1锥形烧瓶。
3.2筒。
3. 3 pH 计或精密 pH 试纸
3. 4高压消毒锅
中华人民共和国卫生部1987-05-28批准网友交流资料
198710-01实施
3.5试。
3.6灭菌平血：直径9cm。
3.7火菌刻度吸管：10ml、2ml、1ml。3.8酒精灯。
3.9恒溫培养箱。
3.10放大镜。
4操作步骤
GB 7918. 287
4.1用灭菌吸管吸取 110 稀释的检样 2ml,分别注入到两个灭菌平血内,每血1ml。另取1ml注入到9ml灭菌生理盐水试管中（注意勿使吸管接触液面），更换--支吸管，并充分混勾，使成1！100稀释液。吸取2ml，分别注入到两个灭菌平血内，每血1ml。如样品含菌量高，还可再稀释成111000,1：10000，.--·-等，每种稀释度应换1支吸管。4.2将熔化并冷室45~50℃的卵磷脂、吐温80、营养琼脂培养基倾洋平血内，每血约15ml，另倾注一个不加样品的灭菌空平皿，作空白对照。随即转动平血，使样品与培养基充分混合均勾，待琼脂固后，翻转平血，置37℃培养箱内培养48h。5菌落计数方法
先用肉眼观察，点数菌落数，然后再用放人5～10倍的放大镜检查，以防遗漏。记下各乎血的菌落数后。求出同·稀释度各平血长的平均菌落数。若平血中有连成片状的菌落或花点样菌落蔓延生长时，该平血不它计数。若片状菌落不到平血中的一半，而其余一半中菌蒋数分布又很均勾，则可将此半个平血菌落计数后乘2,以代表全血菌落数。6菌落计数及报告方法
6.1首先选取平均菌落数在30～300之间的平血，作为菌落总数测定的范围。当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，即以该平血菌落数乘其稀释倍数(见表中例1)。6.2若有两个稀释度，其平均菌落数均在30～300个之间，则应求出两者菌落总数之比值来决定。若其比值小丁或等丁2,应报告其平均数，署大于2则报告其中较小的菌落数（见表中例2及例3)。6.3若所有稀释度的平均菌落数均大于300个，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（见表中例4）。
6.4所有稀释度的均菌落数均少于30个，则应按稀释度最低的均菌落数乘以稀释倍数报告之（见装中例5)。
6.5若所有稀释度的平均菌落数均不在30～300个之间，其中一个稀释度大于300个，而相邻的另-一稀释度小于30个时，则以接近30或300的乎均菌落数乘以蒂释倍数报告之（见表中例6）。6.6若所有的稀释度均无菌生长，报告数为每克或每毫升小于10个。6.7菌落计数的报先，菌落数在10以内时，按实有数值报牛之，大于100时，采用二位有效数字，在一位有效数字后面的数值，应以四舍五入法计算。为了缩短数字后面零的个数，可用10的指数来表示（见下表报告方式栏）。在报告菌落数为不可计”时，应注明样品的稀释度。例
不可计
不可计
附加说明：
不同帮帮度的平
均菌落数
GB 7918. 287
细菌计数结果及报告方法
两稀释
度菌数
本标准由中国预防医学科学院环境卫生监测所归口。菌落总数
个/它或个/ml
513000
本标准由“化妆品微生物标准检验方法”起草小组起草。本标准主要起草人周淑玉。
本标推由中国预防医学科学院环境生监测所负责解释。网友交流资料
报告式
个/B 或个/ml
16000 或1.6× 10*
38000 或 3.8× 10*
27000 或2.7× 104
10000 或 5. 1× 10:
270 或 2. 7 × 10°
31000 或3. 1> 10
中华人民共和国国家标准
化妆品微牛物标准检验方法
粪大肠菌群
Standard methods of microbfofogicaltxaminatlon for cosmeties
Fecal coliforms
UDC668.58:576
.85.07
GB 7918. 387bZxz.net
粪大肠菌群细菌来源于人和温血动物的粪便。检出粪大肠菌群表明该化妆品已被粪便污染，有可能存在其他肠道致病菌或寄生虫等病原体的危险。因此粪大肠菌被列为重要的卫生指标凿。1方法握翼
根据粪大肠菌群所具有的生物特性，如革兰氏阴性无胞杆菌在 44培养24～48h 能发酵乳糖产酸并产气，能在选择性培养基上产生典型菌落，能分解色氨酸产生基质。2培养基和试剂
2.1乳糖胆盐培养基
成分：蛋白陈
猪胆盐
0.4%溴甲酚紫水溶液
蒸缩水
1000ml
制法：将蛋白陈、胆盐及乳糖溶于蒸馏水中，调pH到7.4，Ⅲ1入指示剂，混匀分装试管（每支试管中加一个小倒管）。115℃（1016)20min灭菌。2.2双倍浓度乳糖胆盐培养基
按上述乳糖胆盐培养基成分，蒸馏水量不变，其他戒分量加倍。2.3伊红美蓝(EMB)琼脂
成分：蛋白陈
磷酸氧二钾
2%伊红水溶液
0.5%美蓝水溶液
蒸馏水
1000ml
制法：先将琼脂加到900ml蒸馏水中，加热溶解，然后加入癣酸氢二钾蛋白陈，混勾，使之溶解。再以蒸馏水补足至1000ml。校正pH值为7.2~7.4，分装于烧瓶内，121℃（151b）15min高压灭菌备用。临用时加入乳糖并加热融化琼脂。玲至60左右以无菌手续入灭菌的伊红美蓝溶液，摇勾。倾注平血备用。
中华人民共和国卫生部1987-05-28批准foodmatene
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1987-10-01实施
2. 4蛋白陈水(作基质试验用)
分：蛋白陈(或胰蛋白陈)
氟化销
蒸馏水
GB 7918. 387
1000ml
制法:将上述成分加热熔化,调 pH 值为 7. 0～7. 2,分装小试管,高压灭菌 121℃(15 1b)15 min 。2.5靛基质试剂
柯凡克试剂：将5对二甲氨基苯甲醛溶解于75ml醇中，然后矮慢入浓盐酸25ml试验方法：接种细菌于蛋白陈水中，下41℃培养24h，沿管壁加柯凡克试剂0.3～0.5ml，轻摇试管。阳性者于试剂层显深玫瑰红色。注：蛋白应禽有丰富的色氨酸，每批蛋百藤实来后，应先用已知菌种鉴定后方可使用。2.6革兰氏染色法
2. 6. 1染液制备
2. 6. 1. 1 结晶紫染色液：
结晶紫
95%酒精
1%草酸铵水溶液
将结晶紫溶于酒精中，然后与草酸铵溶液混合。2.6.1.2兰氏碘液：
碘化钾
蒸馏水
将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至00ml。2. 6. 1. 3脱色液;95%乙醇，
2.6.1.4复染液
，沙黄复染液
95%酒精
蒸馏水
将沙黄解于酒精中，然后用蒸馏水稀释b，稀石碳酸复红液：称取碱性复红10g，研细，加95%乙醇100ml，放置过夜，滤纸过滤。取该液10ml，加5%石碳酸水液90ml混合，即为石碳酸复红澈。再取此液i心ml水90ml，即为稀石碳酸复红液。
2.6.2染色法
2. 6. 2.1将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液,染Imin,水洗。2. 6. 2. 2滴加革兰氏碘液.作用 1min，水洗。2.6.2.3滴加95%酒精脱色，约30s，或将酒精滴满整个涂片，立即去，再用酒精滴满整个涂片，脱色 10s.水洗。
2.6.2.4滴加复染液，复染1min，水洗，待干，镜检。2.6.3染色结果
革兰氏阳性菌皇紫色，革兰氏阴性菌红色。注：如用1：10稀释石酸复红染色液作复菜滋，复染时荷仪需10s，3仪器
3.1恒温水或靡水式恒温箱：44℃。量处伴网网友流咨
3.2温度计。
3.3显微镜。
3. 4 载玻片。
3.5接种环。
3. 6电炉。
3.7锥形瓶.
3.8试管。
3. 9小管。
pH计或pH试纸。
3.11高压消毒锅。
灭菌吸管。
灭菌平皿。
4操作步骤
GB7918.387
4.1取 10ml1：10 稀释的样品，加到10ml双倍浓度的乳糖胆盐培养基中，置44C培养箱中培养24～48h，如不产酸也不产气，则报告为粪大肠菌群阴性。4.2如产酸产气，划线接种到伊红美蓝琼脂-板上，置37℃培养18～2h。同时取该培养液1~2滴接种到蛋白陈水中,置 44C培养24h。经培养后，在上述平板上观察有无典型菌落生长。大肠菌群在伊红美蓝琼脂培荠基上的典型菌落垦深紫黑色，圆形，边缘整齐，表面光滑湿润，常具有金属光泽。也有的呈紫黑色，不带或略带金属光译，或粉紫色，中心较深的菌落。亦常为大肠菌群，均应注意挑选。4.3挑敢上述可疑菌落，涂片作革兰氏染色镜检。4.4在蛋白藤水培养液中，加入靛基质试剂约0.5ml，观察靛基质反应。阳性者液面呈玫瑰红色：阴性反应液面呈试剂本色。
5检验结果报告
平板上有典型菌落，并经证实为革兰氏阴性短杆菌，靛基质试验阳性，则可报告被检样品中检出粪大肠菌群。
附加说明：
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中华人民共和国国家标准
化妆品微生物标准检验方法
Standard methods of microbiologicalexamination for cosmetics
Pseudomonas aeruginosa
UnC 668. 58 : 576
.85.07
GB 7918:A—87
绿脓杆菌在自然界分布甚广，空气、水、土壤中均有存在。对人有致病力，带引起人皮肤化脓感染特别是烧伤、烫怖、眼部疾病患者被感染后，常使病情恶化，并可引起败血症，因此，在化妆品卫生标推中规定不得检出绿脓杆菌。
1方法提要
根据本菌生物学特征：革兰氏阴性杆菌，氧化酶阳性，产生绿脓菌素。此外还能波化明胶，述原硝酸盐为亚硝酸盐，在42℃条件下生长等，町与类似菌相区别。2培养基和试剂
2. 1SCDLP 液体培养基
见GB7918，1-·87《化妆品微生物标推检验方法总则》。2.2十六烷三中基漠化铵培养基
成分：牛肉膏
蛋白陈
氯化钠
：十六烷兰中基溴化铵
蒸馏水
1000ml
制法：除琼脂外，将上述成分混合加热溶解，调pH为7.4～7.6，加入琼脂，115℃（101b）20min火菌后、制成平板备用。
2. 3乙酰胺培养基
成分：乙酰胺
氮化钠
无水磷酸氢二钾
无水磷酸二氢钾
硫酸镁(MgS 0.7 H,0)
蒸馏水
1000ml
制法：除琼脂和酚红外，将其他成分加到蒸馏水中，加热溶解，调pH为7.2、加入琼胎、酚红，121'C中华人民共和国卫生部1987-05-28批准网友交流资料
1987-10-01卖施
GB 7918.4-87
(151b)20 min高压灭菌后，制放平板备用。2.4绿脓菌色素测定用培养基
成分至
蛋白陈
氯化镁
硫酸钾
甘油（化学纯）
蒸簡水
1000ml
制法：将蛋白陈，氯化镁和硫酸钾加到蒸馏水中，加温使溶解，调pH 至7.4，加入琼脂和甘油，加热溶解，分装于试管内，115C(101b)20min高压灭菌后，制成斜面备用。2. 5明胶培养基
成分：牛肉膏
蛋白陈
蒸馏水
1000ml
制法：取各成分加在蒸馏水中浸泡 20mnin，随时搅拌加温使溶解，调pH至7.4，分装于试管内，经115℃(10 1b)20 min 灭菌后，直立制成高层备用。2.6硝酸盐蛋白陈水培养基
成分：蛋白陈
酵母浸膏
硝酸钾
亚硝酸钠
蒸馏水
1000ml
制法：将蛋白藤和酵母浸旁加到蒸馏水中,加温使溶解,调H为 7.2，煮沸过滤后补足液量，加入硝酸钾和亚硝酸钠，溶解混匀，分装到加有小倒管的试管中，115℃（101b)20min灭菌后备用。2.7普通琼脂斜面培养基
成分：蛋白陈
牛肉膏
氯化钠
蒸馏水
1000ml
制法：除琼脂外,将其余成分溶解于蒸馏水中，调pH为 7. 2～7. 4，加入琼脂,加热溶解，分装试管，121c（15lb)15min高压灭菌后，制成斜面备用。3仪器
3.1培养箱:37C、42℃。
3.2锥形烧瓶。
3. 3试管。
3.4灭菌平血。
3.5灭菌刻度吸管。
3.6显微镜。
3.7载玻片。
3.8接种针、接种环，
目体网网交次料
3.9电炉。
3.10高压消毒锅，
4操作步骤
GB7918.487
4.1增培养：取1110样品稀释液10ml加到90mlSCDLP液体培养基中，置37C培养18～24h。如有绿脓杆菌生长，培养液表面乡有一薄菌膜，培养液常呈黄绿色或蓝绿色。注：如无SCDIP液体培养基时，可用普通肉涵培养基，尬验含防魔剂的化妆品时，在每10UmI普通肉汤中加1这卵磷脂,7g 吐温 80。
4.2分离培养：从培养液的薄菌膜处挑最培养物，划线接种在千六烷三甲基漠化铵鲸脂平板上，置37℃培养18~～24h。凡绿脓杆菌在此培养基上，其菌落扁无定型，向周边护散或路有蔓延，表面显润，菌落旱灰白色，菌落周围培养基常扩散有水溶性色素，此培养基选择性强，大肠艾希氏菌不能生长，革兰氏阴性菌生长较差。
在缺乏十六烷三甲基溴化铵琼脂时也可用乙酰胺培养基进行分离，将菌液划线接种于平咀中，放37℃培养24h，绿脓杆菌在此培养基上生长良好，菌藩扁平，边缘不整，菌落周圃培养基略带粉红色，具他菌不生长。
4.3染色镜检：挑取可疑的菌落，涂片，革兰氏染色，镜检为革兰氏阴性者应进行氧化酶试验。4.4氧化酶试验，取-一小块洁净的白色滤纸片放在灭菌平血内，用无菌玻璃棒挑取绿腋杆菌可疑菌落涂在滤纸片上，然后在其上滴加一滴新配制的1%二甲基对苯二胺试液，在15～30s之内，出现粉红色或紫红色时，为氧化酶试验阳性，若培养物不变色，氧化酶试验阴。4. 5绿脓菌素试验:可疑菌落 2～3个，分别接种在绿菌素测定用培养基上,置 37℃培养24h，血入鼠仿3～5ml，充分振荡使培养物中的绿脓菌素溶解于氯仿液内，待氣仿提取液呈蓝色时，用吸管将氣伤移到另--试替中加入 1N的盐酸1ml左右，振荡后，静置片刻。如上层盐酸液内出现粉红色到紫红色时为阳性，表示被捡物中有绿脓菌素存在。4.6硝酸盐还原产气试验：挑取被检的纯培养物，接种在硝酸盐陈水培养基中，置37℃培养24h，观察结果。凡在硝酸盐藤水培养基内的小倒管中有气体者，即为阳性，表明该菌能还原硝酸盐，并将亚硝酸盐分解产生氮气。
4.7明胶液化试验，取绿腋杆菌可薇菌落的纯培养物，穿刺接种在明胶培养荐内，置37℃培养24h取出放冰箱10～30mi，如仍呈溶解状时即为明胶液化试验阳性·如凝回不溶者为阴。4.842℃生长试验：挑取纯培养物，接种在普琼脂斜面培养基上，放在41～42℃培养箱中，培养24～48h.缘杆菌能生长，为阳性，而近似的荧光假单胞菌则不能生长。5检验结果报告
被检样品经增菌分离培养后，经证实为革兰氏阴性杆菌，氧化酶及绿脓菌素试验皆为阳性者，即可报告被检样品中检出有绿脓杆菌。如绿菌素试验阴性而液化明胶、硝酸盐还原产气和12C生长试验三者皆为阳性时，仍可报告被检样品中有绿杆菌。附加说明：
本标崔由中国预防医学科学院环境卫生监测所归口。本标准由*化妆品微生物标准检验方法\起小组起草。本标主要起草人周淑玉。
本标准由中国预防医学科学院环境卫生监测所负责解释。中华人民共和国国家标准
化妆品微牛物标准检验方法
金黄色葡萄球茵
Stenidard methods of microblologicalexamination for cosmetics
Staphylococeus aureus
UDC 668.58 - 576
.85.07
GE 7918. 5—87
金黄色葡萄球菌在外界分布较广，抵抗力也较强，能引起人体局部化脓性病灶，严重时可导致败血症，因此化妆品中检验金黄色葡球菌有重要意义。1方法提要
根据本菌特有的形态及培养特性，应用BairdParker平板进行分离，该平板中的氟化锂可抑制革兰氏阴性细菌生长，丙酮酸钠可刺激金黄色葡萄球菌生长，以提高检出率，并利用分解甘露醇和血浆凝固酶等特征，以兹鉴别。
2培葬基和试剂
2.1培养基
2. 1. 1SCDLP 液体培养基
见GB7918.1—87&化妆品微生物标准检验方法总则》。2.1.27.5%的氧化肉汤
成分，蛋白陈
牛肉膏
氮化钠
蒸馏水
1000ml
制法:将,上述成分热溶解,调 pH 为 7. 4,分装,121 C(15 16) 15 min 高压灭菌2.1.3BairdParker平板
成分：胰蛋白陈
牛肉膏
酵母浸膏
丙酮酸钠
甘氨酸
氯化锂(LIC1 · 6 H, 0)
蒸馏水
pH7.0±0.2
增菌剂的配制：30%卵黄盐水50ml与除菌过滤的1%亚确酸钾溶液10ml混合，保存于冰箱内。制法：将各成分删到蒸水中，加热煮沸完全溶解，冷至25℃校正pH。分装每瓶95ml，121℃高压中华人民共和国卫生部1987-05-28批准foodma
网友交流资料
1987-10-01 实施
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