【团体标准】 绵羊尾脂脂肪RNA提取技术规程

ICS 67.120.20 B 40 团体标准 T/SHZSAQS 012—2020 绵羊尾脂脂肪RNA提取技术规程 2020-12-26 发布 2020-12-31 实施 石河子市质量标准化协会 发布 前言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准附录A、B为资料性附录。 本标准起草单位：新疆农垦科学院畜牧兽医研究所。 本标准主要起草人：甘尚权、刘守仁、王新华、徐梦思。 1 范围 本规程规定了提取绵羊尾脂RNA的砸碰锤装置参数、提取绵羊尾脂RNA操作步骤、RNA检测等技术内容。 本规程适用于绵羊尾脂脂肪RNA的提取。 2 提取绵羊尾脂RNA砸碰锤装置 本标准设计的砸碰锤装置是一种在分子生物学实验中使用的震荡装置。其由锤体和与锤体固定连接的手柄组成。 2.1 砸碰锤装置锤体参数 锤体由一可开关的透明圆柱形密闭盒体和有弹性的橡胶块组成。密闭盒体由盖体和杯体组成，其高为8.0~14.0 cm，底面直径为4.0～6.0 cm。橡胶块的高为1.5~2.0 cm，底面直径为4.0~6.0 cm。 3 提取绵羊尾脂脂肪RNA操作步骤 3.1 脂肪组织样品均质化 由于脂肪组织中含有大量油脂，RNA丰度极低，提取脂肪组织RNA时，取150～200 mg绵羊尾部脂肪组织样品，放入5.0 mL离心管中，加入1.2 mL TRIzol试剂，先使用组织破碎仪25000 rpm转速下匀浆5 min，再将匀浆液转移至含有若干钢珠的1.5 mL离心管中旋紧管盖，将离心管放入砸碰锤装置中，在距离桌面高30 cm处向硬物支持面敲击20次，停顿后重复5～6遍。 3.2 液相分离 均质化的脂肪样品于15～30 ℃孵育5 min，加0.2 mL氯仿旋紧管盖，将离心管放入砸碰锤中从距离桌面高30 cm处向硬物支持面敲击20次。15~30 ℃孵育2～3 min后，于2～8 ℃、12000×g下离心15 min。混合物会分离为下层的红色有机相、中间层以及上层无色水相，RNA存在于水相中。 3.3 RNA沉淀 将含有RNA的水相转移至一个新的离心管中，加入0.5 mL异丙醇混合，以从水相中沉淀RNA。室温孵育10 min后，于2～8 ℃、12000×g下离心10 min。离心后会在管侧面和底部形成一个凝胶样沉淀。 3.4 RNA洗涤 将步骤3.3处理后的上清去除，用75%乙醇溶液洗涤RNA沉淀，涡旋混合，2～8 ℃、7500×g离心5 min。 3.5 重新溶解RNA 将步骤3.4洗涤的RNA沉淀真空干燥5～10 min，注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度，加20～30 μL无RNA酶的水中吹打几次溶解RNA，并在55～60 ℃孵育10 min，获得RNA溶液。 3.6 RNA质量检测 用0.7%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，利用核酸蛋白分析仪测定RNA的纯度和浓度。0.7%琼脂糖凝胶检测RNA，28S、18S和5S三条带比较清晰，28S条带亮度约为18S条带亮度的1～2倍，无明显DNA和蛋白质污染，说明RNA完整性较好。RNA样品经核酸蛋白分析仪检测A260/A280在1.9～2.0之间，说明提取总RNA纯度较高。 附录A（资料性附录） 砸碰锤装置侧视图 附录B（资料性附录） 总RNA琼脂糖凝胶电泳图