【团体标准】 食品金黄色葡萄球菌实时荧光核酸恒温扩增

T/CAIA/SH008-2017 中国分析测试协会标准 食品金黄色葡萄球菌实时荧光核酸恒温扩增检测（SAT）方法 Real-Time Simultaneous Amplification and Testing (SAT) method for detecting S. aureus in foods 2017-07-20 发布 2017-10-01 实施 中国分析测试协会发布 前言 本标准按照GB/T 1.1-2009规则起草。 本标准由中国分析测试协会标准化委员会提出并归口。 本标准起草单位：上海交通大学公共卫生学院、中国科学院上海生命科学研究院、上海仁度生物科技有限公司。 本标准的附录A、附录B为资料性附录，附录C为规范性附录。 本标准主要起草人：王慧、邱红玲、储瑞薦、张常娥、于明辉。 本标准为首次发布。 1 范围 本标准规定了食品中金黄色葡萄球菌（S. aureus）的SAT检验技术方法。 本标准适用于肉制品（熟肉制品、即食生肉制品），水产制品（熟制水产品、即食生制水产品、即食藻类制品），乳与乳制品（乳及液态乳制品、半固态乳制品、固态乳制品）中金黄色葡萄球菌的检验。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本文件。 GB 4789.10 食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验 GB 4789.1 食品安全国家标准 食品微生物学检验 总则 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室生物安全通用要求 GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 GB/T 27405 实验室质量控制规范 食品微生物检测 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 恒温扩增实时荧光检测技术（Simultaneous Amplification and Testing：SAT）：指RNA恒温扩增实时荧光检测技术。 4 SAT原理 在同一温度下，以细菌RNA为起始模板，通过M-MLV反转录酶产生靶标RNA的一个双链DNA，然后利用T7 RNA多聚酶以该DNA为模板产生多个（100～1000）RNA拷贝；每个RNA拷贝数再从反转录开始进入下一个扩增循环：同时，带有荧光标记的优化探针和这些RNA拷贝特异结合后，打开茎环结构，从而产生荧光，根据实时荧光信号的出现时间和强度，结合阳性对照和阴性对照即可对检测结果进行判定。 5 材料和设备 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其它设备如下： 5.1 实时荧光恒温检测系统。 5.2 台式离心机。 5.3 恒温培养箱：36℃±1℃。 5.4 振荡器。 5.5 冰箱（2℃~8℃和-20℃或-80℃）。 5.6 均质器。 5.7 电子天平（感量0.1g）。 5.8 微量可调移液器及配套无DNA/RNA酶吸头（10μL、100μL、1000μL）。 5.9 无DNA/RNA酶离心管（0.5mL、1.5mL、2.0mL）。 5.10 水浴槽。 5.11 恒温混匀仪。 5.12 制冰机。 5.13 干热恒温器。 5.14 分光光度计。 5.15 比色皿。 6 试剂 除特别说明外，所用试剂均为分析纯，实验用水为按照GB/T 6682规定的一级水，溶解RNA实验用水必须为无RNA酶污染一级水，所用试剂均用无DNA/RNA酶污染的容器分装。 6.1 7.5%氯化钠肉汤：见附录A中A.1。 6.2 10%氯化钠胰酪陈大豆肉汤：见附录A中A.2。 6.3 无菌生理盐水：见附录A中A.3。 6.4 金黄色葡萄球菌SAT实验相关引物和探针 上游引物：扩增金黄色葡萄球菌种属特异性基因的转录产物RNA的上游引物（序列见附录B中B.1.1）。 下游引物：扩增金黄色葡萄球菌种属特异性基因的转录产物RNA的下游引物，包含T7启动子识别位点（序列见附录B中B.1.1）。 金黄色葡萄球菌特异性探针：探针的5'端标记荧光报告基团FAM，3'端标记荧光淬灭基团DABCYL（序列见附录B中B.1.1）。 内质控RNA（IC-RNA）：体外转录成RNA，加入到每个反应体系中（序列见附录B中B.1.1）。 内质控探针：探针的5'端标记荧光报告基团HEX，3'端标记荧光灭基团DABCYL，识别内质控RNA上的特定序列（序列见附录B中B.1.1）。 6.5 阳性质控品：由有资质的权威机构提供金黄色葡萄球菌标准菌株，-80℃冰箱保存。（来源和编号见附录B.1.1） 6.6 SAT反应液：（成分见附录B.1.1，含M-MLV反转录酶、T7 RNA多聚酶等成分，见附录B.1.1）。 6.7 SAT酶液。 6.8 氯仿。 6.9 异丙醇。 6.10 无水乙醇。 6.11 RNA提取试剂盒。 6.12 溶菌酶。 6.13 Trizol溶液。 7 实验室安全防护 实验室结构和设施、安全操作规程、安全设备及个体防护应符合GB 19489中二级生物安全防护实验的要求。