【SN商检标准】 赤羽病毒实时荧光RT-PCR检测方法

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T3991—2014
赤羽病毒实时荧光RT-PCR检测方法Detection of akabane virus with real-time RT-PCR2014-11-19发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2015-05-01实施
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T3991—2014
本标准起草单位：中华人民共和国宁波出人境检验检疫局、中华人民共和国江苏出入境检验检疫局。
本标准主要起草人：张吉红、唐泰山、黄素文、李如松、倪健波、王建峰、张常印。1
1范围
赤羽病毒实时荧光RT-PCR检测方法本标准规定了赤羽病毒实时荧光RT-PCR检测方法。本标准适用于家畜及其产品中赤羽病毒的检验2规范性引用文件
SN/T3991—2014
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仪注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本义件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验空生物安全通用要求3术语、定义和缩略语
3.1术语和定义
下列术语和定义适应于本文件。3.1.1
实时荧光RT-PCRrealtimeRT-PCR在RT-PCR反应体系中加人荧光基团，利用炭光信号的积累实时监控整个RT-PCR扩增过程。3.1.2
Ct值cyclethreshold
每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。3.2缩略语
下列缩略语适用于本文件。
AKAV：赤羽病毒（Akabancvirus）DEPC：焦碳酸二乙酯（DiethypyrocarbonedNTP：脱氧核苷三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate）FAM：6-羧基荧光素（6-carboxyfiuorescein）PBS：磷酸盐缓冲液（phosphate-bufferedsaline）RNA：核糖核酸(RibonucleicAcid)SDS：十二烷基硫酸钠（Sodiumdodecyl sulate)TAMRA：6-羧基四甲基罗丹明（6-carboxytetramethylrhodanine）Tris：三（羟甲基）氨基甲烷［tris(hydroxymethyl)aminomethaneTag酶：TagDNA聚合酶（TagDNApolymerase)4仪器和设备
4.1荧光定量PCR核酸扩增仪。
SN/T3991—2014
超净工作台。
电了天平。
高速冷冻离心机，台式小型离心机，微型离心机。冷藏冷冻冰箱。
组织勾浆器。
旋涡震荡器。
微量移液器：2μl、10L、20μ、100μL200μ、1000L70℃低温冰箱。
无RNase玻璃容器、无RNase离心管（1.5mL）、无RNase吸头（20μL、200μL、1000μL）、无4.10
RNasePCR薄壁管、无RNase药匙：见A.4。试剂和材料
除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂。实验用水应符合GB/T6682中一级水的规格。所有试剂均用无RNA酶污染的容器分装。5.1
裂解液：Trizol或其他等效裂解液。5.2
三氯甲烷：异戊醇：体积分数24：1。异丙醇：-20℃预冷。
PBS(磷酸盐缓冲液）：见A.1。
无RNase水：见A.2。
75%乙醇：见A.3。
10XRT-PCR缓冲液。
ROX reference dye.
EX Taq HS。
5.10
RNaseInhibitor。
5.11
MMLV RTase.
引物和探针
5.12
引物和探针序列如下.其中探针的5端标记FAM,3端标记TAMRA。上游引物AKAV1:5CCCCTGGTGCTGAGATGTTT-3'下游引物AKAV-2:5-CTTCCTCATGAAGTTGACATCCAT-3探针AKAVprobe:5-ACCCACTGGTTATCGACATGCACCG-3样品的采集和前处理
取样工具
6.1.1棉拭子、剪刀、镊子、离心管。所有上述取样工具应经121℃土2℃.15min高压灭菌并烘干。6.1.2
6.1.3
采样方法
6.2活畜
用无菌注射器直接吸取血液至无菌离心管中，编号备用。2
KAoNiKAca
6.3内脏或肌肉样品
SN/T3991—2014
用无菌的剪刀和镊子剪取待检样品2.0g于组织勾浆器中，加入10mLPBS匀浆，然后将组织悬液转人无菌离心管中3.000r/min离心10min，取上清液转入另一无菌离心管中，编号备用。6.4存放与运送
采集或处理的样本在2℃～8℃条件下保存应不超过24h；若长期保存，应放置一70℃冰箱，似应避免反复冻融（最多冻融3次）。采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，尽快运送到实验室。
7操作方法
样本核酸的提取
在样本处理区进行。为防止RNA降解，所用实验用具及溶液应无RNA酶，操作过程中应自始至终佩戴一次性橡胶或乳胶手套，必要时更换，以避免将皮肤表面的RNA酶污染用具或带人溶液。取200μL病毒液或血清样品加人到1.5mL离心管中，加人1000μl.Trizol试剂，剧烈振荡15s后，室温放置5min。在上述离心管中加入200uL三氯甲烷，用手剧烈振荡15s后室温放置3min。12000r/min离心15min，离心管中液体分成3层，上层水相含有RNA（若样品为病料组织，则需用酚：三氯甲烷、三氯甲烷各抽提一次）。小心吸出上层水相，转移至一个新的1.5mL离心管中，加人0.5mL异丙醇，在室温放置10min。12000r/min离心15min，弃上清液，加入1000μL75%乙醇，在混旋仪上混勾，7500r/min离心5min。倒出上清液，放置15min自然干燥。加入20μLDEPC处理过的无RNA酶双蒸水重新溶解后在室温孵育1Omin。也可使用等效RNA提取试剂盒。提取的RNA应在2h内进行RT-PCR扩增或放置于一70℃冰箱。7.2扩增试剂准备与配制
在反应混合物配制区进行。
检测赤羽病毒的一步法实时荧光RTPCR反应体系见表1。每个反应体系设置两个平行反应。反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整。可采用商业RT-PCR一步法或两步法试剂盒。以赤羽病毒RNA作为阳性对照，以不含有赤羽病毒的动物RNA作为阴性对照，以水代替模板作为空白对照。
表1实时荧光RT-PCR反应体系
RT-RCR缓冲液
aNTPs
Mg+
引物AKAV-1
引物AKAV-2
探针AKAVprobe
贮液浓度
10x
2.5mmol/l
25mmol/L
20pmol/L
20μmol/L
10μmol/L
终浓度
0.25mmol/1
1.9mmol/L
0.6μmol/L
0.6μmol/L
0.3μmol/L
加样量/
-TrKAoNKAca
SN/T3991—2014
ROX reference dye
EXTagHS
M-MLVRtase
RNase Inhihitor
RNase freedH,O
总体积
7.3荧光RT-PCR反应
妙液浓度
50x
5U/μL
表1(续）
200U/μL
40U/ml
终浓度
0.1U/l
2U/ul.
0.8U/uL
加样量/ul
20.0
在检测区进行，将加样后的PCR管放人荧光PCR检测仪内，记录样本摆放顺序。反应参数设置：50℃30min;95℃5min95℃15.60
1mn.40
注：可根据不同仪器或反应试剂盒的要求将反应参数作适当调整8
结果判断
结果分析条件设定
读取检测结果。阈值设定原则以阅值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点，不同仪器可根据仪器噪音情况进行调整。
质控标准
8.2.1
8.2.2
8.2.3
阴性对照：无扩增曲线，Ct值
阳性对照：出现典型的扩增曲线否则.试验视为无效。
结果判定
8.3.1
8.3.2
8.3.3
检测样品的Ct值>38时，则判定赤羽病毒核酸阴性。检测样品的Ct值35时，且出现典型的扩增曲线，则判定赤羽病毒核酸阳性。检测样品的Ct值35且≤38时，或虽然Ct值≤35，但扩增曲线不明显，则应对样品进行复检：若复检后，Ct值≤38，则判定赤羽病毒核酸阳性，Ct值38则判定赤羽病毒核酸阴性。8.4结果验证与描述
样品的实时荧光RT-PCR结果为阳性时，需将PCR产物进行克降测序。把测序所得到的核苷酸序列与已知的赤羽病毒相应序列进行比对（利用NCBI网站上的BLAST软件进行比对，网址为http：//ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）。若测序结果与赤羽病毒没有同源性，则判定赤羽病毒核酸阴性。测序结果与赤羽病毒具有同源性，则判定赤羽病毒核酸阳性-TTTKAONiKAca
生物安全措施
SN/T3991—2014
为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员检测病毒，所有样品污染物应小心处置。并参见GB19489中的有关规定执行。5
-iKAoNiKAca
SN/T3991—2014
磷酸盐缓冲液配方
A.1.1
0.2mol/L磷酸二氢钠水溶液
附录A
（规范性附录）
主要试剂及容器用具
NaHPO,·H.O27.6g溶于蒸馏水中，最后稀释至1000mL。A.1.2
0.2mol/L磷酸氢二钠水溶液
Na2HPO,·7H,053.6g（或NazHPO,.12HO71.6g或NaHPO,·2HO35.6g)加蒸馏水溶解，最后稀释至1000mL。
A.1.3磷酸盐缓冲生理盐水的配制（0.01mol/L、pH7.2）A液
氯化钠
用蒸馏水稀释至1000mL
无RNase超纯水
超纯水
DEPC
14mL
36mL
18.5g
100ml.
50mL
空温过夜，121℃，15min灭菌，或直接购买无RNasc超纯水。75%乙醇
无水乙醇此内容来自标准下载网
无RNase超纯水
现配现用。
玻璃容器及塑料用具
7.5mL
2.5mL
离心管、移液器吸嘴、药匙及玻璃容器等用具应用0.01%的DEPC水室温浸泡过夜，然后灭菌，烘干；或直接购买无RNase的相应规格离心管、移液器吸头等。6
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