【SN商检标准】 牛海绵状脑病特殊风险物质实时荧光RT-PCR检测方法

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3987—2014
牛海绵状脑病特殊风险物质实时荧光RT-PCR检测方法
Detection of specified risk materials of bovine spongiform encephalopathy(BSE)byreal-timefluorescentRT-PCRmethod2014-11-19发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2015-05-01实施
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T3987—2014
本标准起草单位：中华人民共和国北京出入境检验检疫局、北京市兽药监察所、中国合格评定国家认可委员会。
本标准主要起草人：史喜菊、李冰玲、郭志红、马贵平、苏志明、李炎鑫、刘全国。1范围
牛海绵状脑病特殊风险物质实时荧光RT-PCR检测方法
本标准规定了牛海绵状脑病特殊风险物质实时荧光RT-PCR检测方法。本标准适用于牛肉中牛海绵状脑病特殊风险物质的定性检测。2规范性引用文件
SN/T3987—2014
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语定义和缩略语
3.1术语和定义
下列术语和定义适用于本文件
3.1.1
实时荧光PCRrealtimefluoresccntPCR实时荧光聚合酶链式反应。
3.1.2
Ct值cyclethreshold
每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环次数。3.2缩略语
下列缩略语适用于本文件。
GFAP：胶原纤维酸性蛋白（glialfibrillaryacidicprotein）FAM：6-羧基荧光素（6-carboxyfluorescein）MGB：探针标记荧光集团（minorgroovebinder）SRM：牛海绵状脑病特殊风险物质（specifiedriskmaterial）4主要仪器
实时荧光PCR仪。
高速台式冷冻离心机（最高离心力12000g以上）。4.3bzxZ.net
漩涡振荡器。
冰箱（2℃~8℃冰箱、-20℃冰箱、80℃冰箱）。微量移液器及各种配套带滤芯吸头（10uL、200μL、1000pL）。1
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一次性棉签和研磨用具。
5主要试剂
5.1总RNA提取试剂盒。
5.2Ready-To-GoTMRTPCRBeads。5.3TagTMPCR试剂盒。
5.4引物和探针序列：
上游引物序列：5ACCTGCGACCTGGAGTCCT3下游引物序列：5'CTCGCGCATCTGCCG3探针序列：5°6FAM-ACTCGTTCGTGECGCGC-MGB3也可以使用试剂盒中的引物，探针预混液5.5阳性对照
阳性对照为健康牛的脑或脊髓，也可以使用试剂盒中的阳性RNA对照品。5.6
6阴性对照
阴性对照的模板是DEPC处理水。6方法原理
牛海绵状脑病99%的感染性分布在中枢神经组织，主要集中于脑和脊髓。因此，牛海绵状脑病特殊风险物质（SRM)的检测主要是检测中枢神经组织，而中枢神经组织的检测是通过检测其标记物胶原纤维酸性蛋白（GFAP)米实现的。本标准以GFAPmRNA为检测靶目标，通过实时荧光RTPCR技术检测牛海绵状脑病特殊风险物质7检测步骤
7.1样品采集与制备
7.1.1可供检测的样品包括鲜牛肉，冷冻牛肉及其制品。如果样品是组织匀浆，取100L勾浆液；如果样品是固体，选择表面不同区域，用一次性消毒棉签刮取组织表面，每个样品大约25mg。7.1.2每个样品加入600μL裂解液（如果使用棉签刮取，加人裂解液后要用力挤压，将棉签内的液休充分挤出）。
7.1.3加人裂解液的样品可以立即使用，4℃条件下保存不超过48h：若需长期保存应置一80℃冰箱，但应避免反复冻融。
7.2核酸提取
7.2.1取阳性对照100μL，加人裂解液600uL，与加了裂解液的样品一起进行如下处理。7.2.215℃~30℃温育5min：加入0.2mL三氯甲烷，剧烈摇动15s，15℃~30℃温育2min~3min。不超过12000r/min，2℃～8℃离心15min。7.2.3取上层水相，加入0.5mL异丙醇（一20℃预冷），15℃~30℃温育10min，不超过12000/min，2℃8℃离心10min，
7.2.4充去上清液，加入75%乙醇（一20℃预冷）1mL洗涤，以不超过12000/min，2℃~8℃离心2
KAONKACa
5min。
5重复7.2.4步骤一次，可获得更多的RNA7.2.5
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7.2.6弃去上清液，4000r/min离心5s，将液体吸干，快速干燥RNA但不要完全干燥（空气中干燥5min～10min).以免RNA不溶。
7.2.7加人20μLDEPC水，溶解RNA，4000r/min离心5s，冰上保存备用。提取的RNA应在2h内进行PCR扩增，若需长期保存需要放置在一80℃冰箱。7.3
实时荧光RT-PCR检测
7.3.1
实时荧光RT-PCR反应体系
实时荧光RT-PCR反应体系见表1。实时荧光RT-PCR反应体系
上游引物（10pmol/μl）
下游引物（10pmol/μL）
探针（10pmol/μL）
10×PCRBuffer(无Mg+）
dNTPMix(各10mmol/L)
Mg+(25mmol/L)
TaQDNA酶
反转录磁珠Bead
RNA模板
DEPC处理水
总体积
7.3.2
实时荧光RT-PCR反应条件
0.5μL
0.5μL
0.25μl
1.25 μL
1.25μL
3μL
0.25μL
1bead/5个反应
3μL
15μL
25 uL
将加入反应液的PCR管5000r/min离心30s，按下列条件进行检测。RT-PCR反应条件设置：第阶段：反转录，42℃.30min
第二阶段：预变性94℃，3min；第三阶段：94℃，10s，
45℃.30s
72℃，1min，5个循环；
第四阶段：94℃，10s；
60℃，30s（收集荧光），40个循环；第五阶段：40℃，1min降温；
试验结束后，根据收集的荧光曲线和Ct值判定结果。-TTKAoNiKAca
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结果判定
8.1值设定
阅值设定原则以阈值线刚好超过阴性对照扩增曲线的最高点，结果显示阴性为准，根据仪器噪声情况进行调整。
2质控标准
8.2.1
一般要求
检测结果中的阴、阳性对照均应符合以下情况，如果对照不成立，此次试验视为无效。8.2.2
阴性对照
阴性对照无扩增曲线，或Cl值大于35。8.2.3阳性对照
阳性对照出现典型的扩增曲线，且Ct值应小于或等于30.0。8.3
结果判断和报告
8.3.1
阴性判定
在对照成立的情况下，如果检测样品没有出现扩增曲线，且Ct值大于35，则判断没有检测出牛海绵状脑病特殊风险物质，
8.3.2阳性判定
在对照成立的情况下，如果检测样品出现典型的扩增曲线，且Ct值小于或等于30，则判断检测出牛海绵状脑病特殊风险物质。
8.3.3不确定结果
在对照成立的情况下，如果检测样品的扩增曲线不典型，且Ct值大于30小于或等于35，结果不确定，建议重复。重复结果Ct值小于或等于35，则判断检测出牛海绵状脑病特殊风险物质：重复结果Ct值大于35，则判断没有检测出牛海绵状脑病特殊风险物质。
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