【行业标准】 进出口食品中产毒青霉属、曲霉属及其毒素的检测方法

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T10352011
代替SN/T1035—2002
进出口食品中产毒青霉属、
曲霉属及其毒素的检测方法
Determination of Penicillium chrysogenumAspergillus and related toxin in foodstuff for import and export2011-02-25发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2011-07-01实施
本标准按照GB/T1：1一2009给出的规则起草。SN/T1035—2011
本标准代替SN/T1035-2002《进出口食品中产毒青霉属、曲霉属及其毒素的检测方法》。本标准与SN/T1035一2002相比，主要技术变化如下：一将中文名称改为《进出口食品中产毒青霉属、曲霉属及其毒素的检测方法》。一增加了附录B培养基与试剂
本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国天津出人境检验检疫局、中华人民共和国齐齐哈尔出入境检验检疫局。
本标准主要起草人：刘伟、张宏伟、马旭、侯丽萍、张海英、蔡国瑞、贺艳、庞春贤、曲鹏本标准所代替标准的历次版本发布情况为：SN/T1035—2002。
1范围
SN/T1035—2011
进出口食品中产毒青霉属、曲霉属及其毒素的检测方法本标准规定了食品中产毒青霉属、曲霉属及其毒素的检验方法。本标准适用于食品中产毒青霉属、曲霉属及其毒素的检验。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T4789.16食品卫生微生物学检验常见产毒霉菌的鉴定SN/T1538（所有部分）培养基制备指南3试样的制备和保存
3.1试样制备
从原始样品中取出部分有代表性的样品，将可食部分用绞碎机绞碎，充分混匀。用四分法缩分出不少于500g，作为试样。装人清洁容器内，加封并表明标记3.2试样保存
将试样于一18℃以下冷冻保存。在抽样及制样的操作过程中，应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。测定方法
4.1方法提要
以无菌操作称取有代表性的样品，然后进行微生物培养，按照GB/T4789.16中检索表进行镜检鉴定，对可疑的真菌进行产毒培养，用标准菌株检测培养液是否存在毒素，从而得到定性的结果。检验流程参见附录A。
4.2材料和设备
4.2.1试管：直径17mm，长170mm。4.2.2吸管：1.0mL和10mL。
4.2.3离心机：3000g。
4.2.4振荡器。
4.2.5培养m：内径90mm。
4.2.6载玻片和盖玻片。
4.2.7U形玻璃棒。
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4.2.8定性滤纸。
4.2.9牛津杯：外径8.0mm±0.1mm，内径6.0mm±0.1mm，高10.0mm士0.1mm。4.2.10毛细管。
4.2.11游标卡尺。
4.2.12显微镜。
4.2.13标准菌株：巨大芽孢杆菌（Bacillusmegatherium）。4.2.14标准产毒真菌菌株：纯绿青霉（Penicilliumviridicatum）、桔青霉（Penicilliumcitrinum）、寄生曲霉（AsperigillusParasiticus）、杂色曲霉（Asperigillusversicolor）。4.3培养基和试剂
除另有规定外，试剂均为分析纯，水为蒸馏水。4.3.1肉汤培养基：参见B.2。
4.3.2孟加拉红培养基：参见B.3。4.3.3察氏培养基：参见B.4。
4.3.4产毒培养基：参见B.5。
4.3.5营养琼脂培养基：参见B.6。4.3.620%甘油水溶液。
4.4细菌菌种培养和芽孢悬浮液的制备4.4.1菌种培养
将装有菌种的安瓶上部消毒后敲碎，加人少量肉汤培养基，使其溶解并移至肉汤管中混匀，置于37℃土1℃培养6h.再转接至另一肉汤管中37℃士1℃培养18h。将培养物接种于营养琼脂斜面，37℃土1℃培养1周，镜检，芽孢数达85%以上时便可制备芽孢混悬液。4.4.2芽孢混悬液的制备
用适量灭菌生理盐水冲洗菌苔，然后将该菌液移至离心管中，充分摇勾后于3000g离心30min，弃去上清液，再加人同样量的灭菌生理盐水，摇匀后65℃水浴中加热30min，然后于1000g离心5min，取上清液并转人灭菌试管中，即为芽孢悬浮液，稀释并测定浓度，置于冰箱中4℃保存。4.5检验步骤
4.5.1接种培养
4.5.1.1样品制备
精确称取25g（或吸取25mL）有代表性的样品，放人装有225mL无菌水的三角瓶或广口瓶中，振荡30min，然后10倍递增稀释至所需要的浓度。4.5.1.2分离培养
用灭菌吸管吸取1mL样品液放人平血内加人15mL～20mL溶化并冷却到55℃土1℃的孟加拉红琼脂充分混匀，置25℃～28℃培养箱中培养3d5d。4.5.1.3选择培养（点种法）
挑取孟加拉红培养基上生长的可疑菌落转接于察氏培养基上（从一个菌落挑取分别接种一点或三2
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点），于25℃～28℃培养3d～5d，观察菌落的天小、形态、特征或孢子的形态特征、颜色、气味、溢水等4.5.1.4小室培养法（载片培养法）对产生极小而易碎的分生抱子梗的真菌，可用小室培养法对菌丝和子实体着生状态进行观察。取直径约为90mm的圆形滤纸一张，铺于直径90mm的培养血底部，放一U形玻璃棒于滤纸上，其上平放一个洁净的载玻片，盖好培养Ⅲ后灭菌。吸取10mL加热熔化的察氏培养基，注人另一灭菌培养Ⅲ中，使其凝成薄层，用解刀无菌地把琼脂切成1cm的正方形，并将此正方形琼脂片移置已备好的载玻片中央用接种针从孟加拉红琼脂平板上转将可疑菌接种在琼脂边缘，然后将盖玻片覆盖在琼脂上。为了防止在培养过程中琼脂干燥，可于滤纸上加注2mL～3mL灭菌的20%甘油液，置于25℃～28℃温箱中，即成为小室保温培养。培养3d～5d，直接在低倍显微镜下观察菌株生长的细微结构、特征，进行描绘并做好详细记录。
4.5.2鉴定
根据菌落形态，特征及孢子或子实体的细微结构，按照GB/T4789.16中检索表，初步鉴定出真菌的属名或种名。
4.5.3产毒判定
4.5.3.1产毒培养
将长有符合形态菌及长有标准菌株的孟加拉红琼脂无菌操作切成2cm，小块，分别接种于两瓶装有500mL产毒培养液的1000mL三角瓶中，于25℃28℃培养1周后开始测毒4.5.3.2过滤
取5mL培养后的产毒培养液在无菌条件下用单层定性滤纸过滤，滤液置于4℃冰箱待测，剩余的培养液盖好棉塞继续培养。
4.5.3.3抑菌培养
将熔化并冷却至50℃～55℃的察氏培养基中加人适量的芽孢悬液后（10°CFU/mL的巨大芽孢杆菌悬液按1%加人）充分混匀，然后每个灭菌培养Ⅲ中倾注6mL~8mL，凝固后每Ⅲ中按对角线位置加放牛津杯4个，两个对角线位置分别加满标准产毒培养滤液及未接菌的产毒培养液，另两个对角线位置滴加待测样品的滤液，每个样品平行做两套平板，于30℃培养18h。5判定结果
5.1菌属鉴定结果
根据4.5.2中鉴定出真菌的属名或种名报告结果。5.2毒素检出结果
标准产毒菌株滤液产生清晰的抑菌圈，且直径平均值≥12mm（未接菌的空白培养液无抑菌圈）时测量样品滤液，培养1周后开始测毒直至第14天。本方法的测定低限为0.2mg/kg。测量直径平均值≥12mm报告产毒阳性。无抑菌圈或其直径<12mm报告产毒阴性。3
SN/T 1035—2011
小笠薪养
25 7-28 0 3 d--5 d
附录A
（规范性附录）
检验流程图
稀释 (儿个适当稀群件数)
孟加拉红(分离培养)
无抑菌或菌阔点径平12 mrm
繁氏培茅
25 C --28 'T3 d-5 d
查检索表(树步鉴定和和)
产森职养被
25 --2R C,培养7d14d
定性测牵
抑菌菌径平12 m
图A.1产毒青霉属、曲霉属及其毒素的检测流程图4
B.1制备要求
附录B
（规范性附录）
培养基与试剂
SN/T10352011
为保证培养基的质量，应按SN/T1538.1和SN/T1538.2进行培养基的制备与性能测试。若使用商售的脱水合成培养基，应选用国内外通过ISO9000质量体系认证生产厂商的产品并按其说明制备和使用。B.2营
营养肉汤
B.2.1成分
蛋白陈
牛肉膏
氯化钠
蒸馏水
1000mL
将上述成分混合·溶解后调整pH7.4.121℃高压灭菌15min。B.3
孟加拉红培养基
B.3.1成分
蛋白陈
葡萄糖
磷酸二氢钾
硫酸镁
1/3000孟加拉红溶液
氯霉素
蒸馏水
1000mL
将各成分加入蒸馏水中溶解后，再加孟加拉红溶液。另用少量乙醇溶解氯霉素加人培养基中，分装后，121℃高压灭菌20min。
B.4察氏培养基
B.4.1成分
硝酸钠免费标准下载网bzxz
SN/T1035—2011
磷酸氢二钾
硫酸镁
氯化钾
硫酸亚铁
蒸馏水
1000mL
加热溶解，分装后121℃高压灭菌20min。B.5
产毒培养基
B.5.1成分
胰消化酪蛋白
蛋白陈
氯化钠
磷酸氢二钾
磷酸二氢钾
氯化钙
硫酸镁
蒸馏水
1000mL
将各成分加入蒸馏水中，混匀，溶解后调整pH7.2～7.4，121℃高压灭菌15min。B.6
营养琼脂
B.6.1成分
蛋白陈
牛肉膏
氯化钠
蒸馏水
15.0g20.0g
1000mL
将除琼脂以外的各成分混合溶解于蒸馏水中，溶解后调整pH7.2～7.4.加入琼脂，加热煮沸，使琼脂融化。121℃高压灭菌15min。6
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