【行业标准】 新城疫检疫技术规范

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T0764—2011
代替SN/T0764—1999.SN/T1109—2002.SN/T1110—2002.SN/T1686—2005新城疫检疫技术规范
Quarantineprotocolfornewcastledisease2011-05-20发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2011-12-01实施
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。SN/T0764—2011
本标准代替SN/T0764—1999《出口家禽新城疫病毒检验方法》、SN/T1686—2005《新城疫病毒中强毒株检测方法荧光RT-PCR法》、SN/T1109一2002《新城疫微量红细胞凝集抑制试验操作规程》和SN/T1110—2002《新城疫病毒分离及鉴定方法》。本标准与SN/T07641999、SN/T11092002、SN/T11102002和SN/T16862005相比，主要技术变化如下：
-增加了临床诊断；
增加了反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）；删除了毒力测定的鸡胚平均致死时间（MDT)和静脉致病指数（IVPI)。本标准修改采用OIE《陆生动物诊断试验和疫苗手册》（2009版）（ManualofDiagnosticTestsandVaccinesforTerrestrialAnimals)中第2.3.14章本标准与OIE第2.3.14章相比，主要技术差异如下：本标准完全采用了OIE规定的病原分离与鉴定、血凝和血凝抑制试验方法；本标准增加了OIE中提及但没有详细操作规程的反转录-聚合酶链反应、荧光反转录-聚合酶链反应的具体试验步骤：
本标准删除了OIE中提及但没有详细操作步骤的酶联免疫吸附试验请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国珠海出入境检验检疫局、中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中华人民共和国北京出入境检验检疫局、中华人民共和国江苏出人境检验检疫局、中华人民共和国山东出入境检验检疫局、中华人民共和国广东出人境检验检疫局、中华人民共和国内蒙古出人境检验检疫局。
本标准主要起草人：徐海聂、胡永强、罗宝正、谷强、张常印、薄清如、廖秀云、王云华、沙才华、管恩平、邱阳、朱广勤、王海艳本标准所代替标准的历次版本发布情况为：-SN/T0764-1999；
-SN/T1109—2002；
-SN/T1110-2002;
SN/T1686—2005。
1范围
新城疫检疫技术规范
SN/T0764—2011
本标准规定了禽类新城疫的临床诊断、病毒分离与鉴定、血凝和血凝抑制试验、反转录-聚合酶链反应、荧光反转录-聚合酶链反应的操作规程。本标准适用于进出口禽类及其产品中新城疫的检疫规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3临床诊断
3.1发病症状
新城疫简介参见附录A。当禽出现以下部分或全部情形时，可作为初步诊断的依据之一：发病急，死亡率高；
体温升高，极度精神沉郁，呼吸困难，食欲下降；c）
粪便稀薄，呈黄绿色或黄白色；d)
出现扭颈、翅膀麻痹等神经症状；免疫禽群出现产蛋下降。
病理变化
当禽出现以下肉眼可见的病变时，可作为初步诊断定性的依据之一：全身粘膜和浆膜出血，以呼吸道和消化道最为严重；a
腺胃粘膜水肿，乳头和乳头间有出血点；盲肠扁桃体肿大、出血、坏死；c）
d）十二指肠和直肠粘膜出血，有的可见纤维素性坏死病变；脑膜充血和出血·鼻道、喉、气管粘膜充血、偶有出血，肺可见淤血和水肿。e)
当禽出现上述病变时，应进行实验室确诊。4实验室诊断
4.1病毒分离与鉴定
4.1.1设备、材料和试剂
器材：生物安全柜、离心机、V型微量血凝板、微量可调移液器、恒温箱等。4. 1.1.1
SN/T0764—2011
4.1.1.2抗生素：青霉素、链霉素、卡那霉素和制霉菌素等。4.1.1.39日龄~11日龄SPF鸡胚、1日龄SPF雏鸡、4.1.1.4pH7.0~7.4.0.01mol/L等渗磷酸盐缓冲液(PBS)：配制方法见附录B4.1.1.50.2mol/L磷酸氢二钠：配制方法见附录B。4.1.1.6阿氏液：红细胞保存液，配制方法见附录B。4.1.1.71%鸡红细胞（RBCs)：配制方法见附录B4.1.1.8拭子：脱脂棉球直径约0.4cm，1.034X105Pa高压蒸汽灭菌15min。4.1.1.9新城疫病毒标准阳性血清和标准阴性血清：由指定单位提供。4.1.2样品采集和制备
4.1.2.1活禽采集咽喉拭子和泄殖腔拭子（需带有可见粪便），维禽采集新鲜粪便。4.1.2.2死禽无菌采集肺、肾、肠（包括内容物）、脾、脑、肝、心组织和骨髓，采集咽喉拭子。这些样品可单独或者混合存放，但肠内容物需单独处理。4.1.2.3样品置于含抗生素的pH7.0～7.4等渗磷酸盐缓冲液（PBS),组织和咽喉拭子保存液中含青霉素（2000U/mL）、链霉素（2mg/mL）、卡那霉素（50μg/mL）和制菌霉素（1000U/mL），而粪便、肠内容物和泄殖腔拭子保存液抗生素浓度应提高5倍。加入抗生素后用0.2mol/L磷酸氢二钠调pH值到7.0~7.4。
4.1.2.4粪便和搅碎的组织，用含抗生素的PBS制成10%～20%（质量浓度）的悬浮液，拭子浸人2mL3mL含抗生素的PBS中，充分振荡。在4℃作用4h或过夜，或室温（不超过25℃）作用1h~2h，或37℃作用30min。拭子在反复挤压后弃去，4.1.2.54℃3000r/min离心10min取上清液经0.22um滤膜过滤除菌。4.1.2.6采集或处理的样品在2℃～8℃条件下保存应不超过4d，若需长期保存，应放置一70℃冰箱，但应避免反复冻融。采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，尽快运送到实验室。4.1.3病毒分离培养
4.1.3.1鸡胚接种
吸取除菌液经尿囊腔接种至少5枚9日龄～11日龄的SPF鸡胚.0.2mL/枚，35℃～37℃孵育4d～7d。接种后每天检查鸡胚生长情况。4.1.3.2病毒收获
收集死胚、濒死鸡胚和培养结束时存活的鸡胚，置冰箱4℃致冷4h～24h.无菌采集尿囊液。4.1.4病毒鉴定
4.1.4.1血凝试验（HA）
用HA检测尿囊液的血凝活性。HA呈阴性反应的尿囊液用另一批9日龄～11日龄的SPF鸡胚至少再传代一次，若HA结果仍为阴性，则判定新城疫病毒分离阴性。试验方法同4.2.3。4.1.4.2血凝抑制试验（HI)
HA呈阳性的尿囊液用新城疫病毒标准阳性血清进行HI试验，以确认是否有新城疫病毒的存在。试验方法同4.2.4。
4.1.5脑内接种致病指数(ICPI)测定SN/T0764—2011
4.1.5.1HA滴度高于2（大于1/16）的新鲜感染尿囊液（不超过24h～48h，细菌检验为阴性）、用等渗无菌盐水作10倍稀释，不加添加剂如抗生素。4.1.5.2脑内接种出壳24h～40h的SPF维鸡，共接种10只，每只接种0.05mL。4.1.5.3每24h观察一次，共观察8d。4.1.5.4每天观察应给鸡打分，正常鸡记作0，病鸡记作1，死鸡记作2（每只死鸡在其死后的每日观察中仍记作2）。
ICPI是每只鸡8d内所有每次观察数值的平均数，计算方法见式（1）：4.1.5.5
ICPI =2,X1+2, ×2
式中：
Z，—8d累计发病数；
Z—8d累计死亡数；
-8d累计观察鸡的总数
ICPI越大，新城疫病毒致病性越强，最强毒力病毒的ICPI将接近最大值2.0，而弱毒株的ICPI近于0。使用弱毒疫苗，分离株的ICPI值在0.7以上，可认为强毒力病毒感染4.2
血凝（HA)和血凝抑制试验（HI)）4.2.1材料和试剂
器材：V型微量血凝板、微量可调移液器等。4.2.1.1
pH7.0~7.2.0.01mol/L等渗磷酸盐缓冲液（PBS）。4.2.1.31%鸡红细胞（RBCs）。
4.2.1.4标准新城疫病毒抗原、阳性对照血清和阴性对照血清。4.2.1.54HAU抗原：配制方法见附录B。4.2.2样品采集和处理
4.2.2.1新城疫病毒悬液：无菌收取鸡胚尿囊液。4.2.2.2鸡血清：无菌采取动物血液，凝固后分离血清，置于4℃或一20℃保存备用4.2.2.3除鸡外其他禽种的血清：需排除血清对鸡红细胞的非特异性凝集，处理方法为每0.5mL血清加25μl鸡红细胞泥，轻轻振荡，静置至少30min，澄清，2000r/min离心2min～5min，红细胞沉聚，吸出吸附过的血清供检。
4.2.3血凝试验（HA)
4.2.3.1在V型微量血凝板中每孔加25μLPBS。见表1。3
SN/T 0764—2011
抗原滴度1og2）
抗原（倍比稀释)
1%鸡红细购
作用时间及温度
判定率例
血凝试验操作术式
空温（约20℃）下游置40min左右10
单位为微升
一去25
4.2.3.2第1孔加入25L病毒悬液（如尿囊液），为精确计算血凝单位，病毒悬液开始可以作一系列密集稀释，如1/3，1/5，1/7等。4.2.3.3将病毒悬液或抗原在反应板上作25μL的系列倍比稀释。第12孔不加病毒悬液或抗原，设立为红细胞对照孔：
4.2.3.4每孔再加25μLPBS。
每孔加人25uL1%RBCs。
4.2.3.6轻叩微量血凝板混合反应物，室温（约20℃）静置40min，或4℃静置60min（若周围环境温度太高），在对照孔的RBCs显著呈钮扣状时判定结果4.2.3.7HA判定时，应将反应板倾斜，观察RBCs有无呈泪珠样流消，完全凝集（无泪珠样流消）的病毒最大稀释倍数为该抗原的血凝滴度，表示1个血凝单位（HAU），再根据开始的稀释倍数精确计算血凝滴度。
4.2.4血凝抑制试验(HI)
在V型微量血凝板中每孔加入25μLPBS。见表2。表2
清稀释度(lom2)
被检血清倍比稀释
411AU抗原
作用时间及温度
1%鸡红细胞
作用时问及温度
判定举例
血凝抑制试验操作术式
4.2.4.2第一孔加25μL血清。
室温（约20℃）下静置至少30mim25
室温（约20）下游置至少40min
4.2.4.3在血凝板上将血清作横向的25L的倍比稀释。25
单位为微升
4.2.4.4每孔加人25μL4HAU抗原，室温下（20℃）静置不少于30min，4℃不少于60min。4.2.4.5每孔加人25L1%（体积分数）的RBCs，轻混匀后，室温（约20℃）静置约40min，如环境温度太高时，4℃放置约60min，当对照孔RBCs呈显著钮扣状时判定结果4.2.4.6每次测定应设已知滴度的阳性血清、阴性血清和红细胞对照。4.2.4.7结果判定如下：
SN/T0764—2011
a）红细胞均匀分散在孔底周围、倾斜血凝板时不流判为完全凝集，记作十十十十；75%凝集记作十十十，50%凝集记作十十；25%凝集记作十；红细胞集中在孔底中央呈圆点、倾斜血凝板时与对照孔（仅含25μLRBCs和50μLPBS)RBCs流尚相同的孔判定为不凝集或血凝抑制，记作一；
完全抑制4HAU抗原的最高血清稀释倍数为HI滴度；b）
检查各种对照。阴性对照血清HI滴度不高于1：4（2或2log2)，阳性对照血清HI滴度应在c）
已知滴度的一个稀释度以内，红细胞对照无自凝现象，结果有效，试验成立；d
如果1：16（2*或4log2)稀释的血清或者高于这个稀释度的血清能抑制4HAU的抗原，这种HI滴度被判为阳性。
4.2.4.8在所有的确诊试验当中针对试验采用的HAU应设抗原滴度的追溯性测定。4.3反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）4.3.1主要仪器设备
4.3.1. 1PCR仪。
4.3.1.2凝胶电泳仪。
4.3.1.3电泳仪。
4.3.1.4紫外凝胶成像管理系统
4.3.1.5高速冷冻离心机。
4.3.1.6微量可调移液器。
4.3.1.7生物安全柜。
4.3.2试剂
DEPC水：配制方法见附录B。
4.3.2.2裂解液Trizol:4℃保存。三氯甲烷：一20℃预冷
4.3.2.4异丙醇：一20℃预冷
4.3.2.575%乙醇：用新开启的无水乙醇和DEPC水配制，一20℃预冷0.01mol/L（pH7.2)PBS：1.034X10°Pa，15min高压灭菌冷却后，无菌条件下加人青霉素、4.3.2.6
链霉素各10000IU/mL。
反转录和PCR10X缓冲液。
AMV反转录酶（5U/μL）：-20℃保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。RNA酶抑制剂（40U/μL)：一20℃保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。TaqDNA聚合酶（5U/μL）：一20℃保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。dNTPs：含dCTP、dGTP、dATP、dTTP各10mmoL/L。氯化镁（25mmol/L）。
电泳缓冲液（5XTBE贮存液）：配制方法见附录B溴化乙锭溶液（10mg/mL）：配制方法见附录B。1.5%琼脂糖凝胶：配制方法见附录B。DNA相对分子质量标准物Marker：DL2000。7上样缓冲液。
SN/T 0764—2011
4.3.2.18引物（Primer）：10μmoL/L。根据F基因序列设计，扩增产物长度为535bp上游引物P15'-ATGGGCYCCAGAYCTTCTAC-3”下游引物P25-CTGCCACTGCTAGTTGTGATAATCC-3”4.3.3样品的采集与前处理
4.3.3.1活禽和内脏组织：见4.1.2。4.3.3.2血清或血浆：用无菌注射器直接吸取至无菌离心管中。4.3.4试验步骤
4.3.4.1样品核酸的提取
4.3.4.1.1在样品处理区，取n个1.5mL灭菌离心管，其中n为待检样品数、一管阳性对照及一管阴性对照之和，对每个管进行编号标记。4.3.4.1.2每管加人600μL裂解液，然后分别加入待测样品、阴性对照和阳性对照各200μL，一份样品换用一个吸头。再加入200uL三氯甲烷，混匀器上振荡混匀20s，室温静置10min。于4℃条件下，12000r/min离心15min。
4.3.4.1.3取与4.3.4.1.1中相同数量的1.5mL灭菌离心管，加入500μL异丙醇（-20℃预冷），对每个管进行编号。吸取4.3.4.1.2离心后各管中的上清液转移至相应的管中，上清液至少吸取500uL注意不要吸出中间层，颠倒混匀。4.3.4.1.4于4℃条件下，12000r/min离心15min（离心管开口保持朝离心机转轴方向放置）。轻轻倒去上清液，倒置于吸水纸上，吸干液体，不同样品应在吸水纸不同地方吸干。加人600μL75%乙醇，颠倒洗涤。
4.3.4.1.5于4℃条件下，12000r/min离心10min（离心管开口保持朝离心机转轴方向放置）。轻轻倒去上清液，倒置于吸水纸上，吸干液体，不同样品应在吸水纸不同地方吸干。4.3.4.1.64000r/min离心10s，将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量加样器尽量将其吸干，一份样品换用一个吸头，吸头不要碰到有沉淀一面，室温干燥约3min。不宜过于干燥，以免RNA不溶。4.3.4.1.7加人20μLDEPC水，轻轻混匀，溶解管壁上的RNA，2000r/min离心5s，冰上保存备用。提取的RNA应在2h内进行RT-PCR扩增或保存于一70℃冰箱，将核酸转移至反应混合物配制区。4.3.4.2RT-PCR扩增
以下操作应在反应混合物配制区的冰盒上进行，按表3配制RT-PCR反应体系。试验过程中要设立阳性对照、阴性对照和空白对照。建议配制检测样品总数所需反应液，可以多配一个样品使用量。表3PT-PCR反应体系配置表此内容来自标准下载网
10×缓冲液
AMV反转录酶
RNA酶抑制剂
TaqDNA聚合酶
上游引物P1
下游引物P2
模板RNA
DEPC水
总体积
表3（续）
将以上反应体系瞬时离心充分混匀后，置PCR仪内运行下列程序：42℃45min，1个循环；
-95℃3min.1个循环；
94℃30s，55℃30s.72℃45s30个循环；-72℃7min，1个循环；
PCR产物置4℃保存。
4.3.4.3PCR产物电泳
SN/T0764—2011
制备1.5%琼脂糖凝胶板，取5μLPCR产物和0.5μL上样缓冲液混，加入凝胶板加样孔，同时加Marker、阴性对照和阳性对照。5V/cm电压电泳30min～40min。紫外凝胶成像管理系统内观察结果、照像。
4.3.5结果及判定
4.3.5.1阳性对照出现535bp目的条带.阴性对照和空白对照均未出现目的条带，试验成立。4.3.5.2被检样品出现535bp目的条带，判为阳性4.3.5.3被检样品未出现535bp目的条带，判为阴性，4.3.5.4对于扩增到的目的片段，需进一步进行序列测定，从分子水平确定其致病性强弱。根据序列测定结果，对毒株F基因编码的氨基酸序列进行分析，如果毒株F2蛋白的C端有“多个碱性氨基酸残基”，F1蛋白的N端即117位为苯内氨酸，可确定为新城疫强毒感染。“多个碱性氨基酸”指在113位到116位残基之间至少有三个精氨酸或赖氨酸，4.4实时荧光反转录-聚合酶链反应（荧光RT-PCR）4.4.1试剂和仪器
4.4.1.1试剂
4.4.1.1.1新城疫病毒荧光RT-PCR检测试剂盒：试剂盒的组成、说明及使用注意事项参见附录C。4.4.1.1.2其他试剂见4.3.2.1~4.3.2.6。4.4.1.2主要仪器设备
4.4.1.2.1荧光PCR仪。
其他仪器设备见4.3.1.5~4.3.1.7。4.4.1.2.2
4.4.2样品的采集与前处理
见4.3.3。
SN/T0764—2011
4.4.3试验步骤
4.4.3.1样品核酸的提取
见4.3.4.1。
4.4.3.2扩增试剂准备与配制
在反应混合物配制区进行。
从试剂盒中取出NDVRT-PCR反应液，在室温下融化后，2000r/min离心5s。设所需PCR反应数为n，其中n为待检样品数、一管阳性对照及一管阴性对照之和。每个测试反应体系需使用15μLRT-PCR反应液及0.25uLTaqDNA聚合酶。计算各试剂的使用量，加入一适当体系试管中，向其中加人1/4Xn颗RT-PCR酶颗粒，充分混合均匀，向每个反应管中各分装15μL.转移至样品处理区。4.4.3.3加样
在样品处理区进行。在各反应管中分别加入4.3.4.1.7中制备的RNA溶液10uL，使总体积达25μL。盖紧管盖后，500r/min离心30s。4.4.3.4荧光RT-PCR反应
在检测区进行。将4.4.3.3中加样后的反应管放人荧光PCR仪内，记录样品摆放顺序。反应参数设置：
反转录42℃30min：
预变性92℃3min；
—92℃10s，45℃30s72℃1min5个循环；—92℃10s.60℃30s.40个循环，荧光收集设置在第四阶段每次循环的退火延伸时进行。注：不同的荧光PT-PCR检测试剂可以选择不同的反应条件4.4.4结果判定
4.4.4.1结果分析条件设定
读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，不同仪器可根据仪器噪音情况进行调整。
4.4.4.2质控标准
4.4.4.2.1阴性对照无Ct值并且无扩增曲线。4.4.4.2.2阳性对照的Ct值应≤30.0.并出现特定的扩增曲线。4.4.4.2.3如阴性对照和阳性对照不同时满足以上条件，此次实验视为无效。4.4.4.3结果描述及判定
4.4.4.3.1阴性
无Ct值并且无扩增曲线，表明样品中无中强毒株新城疫病毒4.4.4.3.2阳性
Ct值≤30.0，且出现特定的扩增曲线，表示样品中存在中强毒株新城疫病毒8
综合判定
SN/T 0764—2011
5.1临床诊断符合第3章规定的临床症状和病理变化，按4.1进行病毒分离与鉴定结果为新城疫病毒阳性且ICPI≥0.7.诊断为新城疫5.2临床诊断符合第3章规定的临床症状和病理变化，按4.3进行RT-PCR检测结果呈阳性且经序列分析证明F蛋白裂解位点具有强毒特征，诊断为新城疫。5.3临床诊断符合第3章规定的临床症状和病理变化，按4.4进行荧光RT-PCR检测结果呈阳性，诊断为新城疫
5.4患禽没有明显的临床症状和病理变化，但病原检测符合5.1或5.2或5.3，可判定为新城疫病毒感染。
SN/T 0764—2011
附录A
（资料性附录）
新城疫简介
A.1新城疫(ND)是由副黏病毒科禽腮腺炎病毒属的禽副黏病毒I型（APMV-1)引起的一种急性、热性、败血性和高度接触性传染疾病，主要侵害鸡和火鸡，其他禽类和人亦可受到病毒感染。新城疫一年四季均可发生，但以春秋季较多。鸡场内的鸡一旦发生本病，可于4d～5d内波及全群。本病特征是高热、呼吸困难、下和出现神经症状。新城疫病毒粒子呈圆形，大小为120nm～300nm，多数在180nm左右·大部分呈蝌蚪状，有囊膜和纤突。核衣壳呈螺旋对称，基因组为不分节段的单股负链RNAA.2病禽是本病主要传染源，鸡在感染后的24h，口、鼻分泌物和粪便中开始排出病毒，在流行间歇期的带毒鸡，也是本病的传染源。鸟类也是重要的传播者。NDV可经消化道或呼吸道，也可经眼结膜、受伤的皮肤和泄殖腔黏膜侵人机体，24h内很快在侵入部位繁殖，随后进入血液扩散道全身，引起病毒血症。新城疫的潜伏期为2d～15d或更长，平均为5d～6d。临床症状受病毒毒株的致病型的影响,OIE根据在感染鸡所引起的临床症状将NDV的毒株分5个致病型，它们是：嗜内脏速发型：高致病型，常见肠出血性病变；一嗜神经速发型：高死亡率，常有呼吸和神经症状；一中等速发型：有呼吸症状，偶有神经症状，但死亡率低；一温和型或呼吸型：症状温和或呈亚临床呼吸道感染；无症状肠型：常为亚临床性肠感染。A.3病型界限很难划分，甚至在感染的无特定病原（SPF)鸡上也可以看到若干型的症状。此外，当其他的病原微生物混合感染或环境恶化时·温和株也可引起明显的临床症状。由于鸡的临床症状差别很大，不同宿主对感染的反应也不一样，因此根据流行病学、临床症状和部检变化进行综合分析判断只能作出初步诊断，确诊需要通过实验室方法。10
小提示：此标准内容仅展示完整标准里的部分截取内容，若需要完整标准请到上方自行免费下载完整标准文档。