【SN商检标准】 出口食品中致病菌检测方法微滴式数字PCR法第3部分:溶藻弧菌

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T5364.3—2021 出口食品中致病菌检测方法 微滴式数字PCR法 第3部分：溶藻弧菌 Droplet digital PCR method for detection of pathogens in export food - Part 3: Vibrio alginolyticus 中华人民共和国海关总署 发布 2022-06-01 实施 前言 本文件按照 GB/T1.1-2020 《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》起草，由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件为 SN/T5364—2021《出口食品中致病菌检测方法 微滴式数字PCR法》第3部分，涉及溶藻弧菌检测。本文件起草单位包括中国海关科学技术研究中心、中国检验检疫科学研究院、天津海关。主要起草人：李丹、徐蕾蕊、魏海燕、魏咏新、马丹、付薄博、赵晓娟、曾静、董志珍、高飞。 1 范围 本文件规定了出口食品中溶藻弧菌的微滴式数字PCR检测方法，适用于食品中溶藻弧菌的快速定性检测。检出限为1 CFU/25 g～5 CFU/25 g（或1 CFU/25 mL～5 CFU/25 mL）。 2 规范性引用文件 下列文件通过文中规范性引用构成本文件条款： - GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 - GB/T 27403-2008 实验室质量控制规范 - NMKL No.156 食品致病性弧菌的检测和计数 注：带日期的文件仅该版本适用，未注日期的文件适用最新版本及其修改单。 3 术语和定义 本文件无特定术语需界定。 4 缩略语 PCR（polymerase chain reaction）：聚合酶链式反应。 5 方法原理 针对溶藻弧菌 GroEL 基因保守序列设计引物和探针，将引物、探针与模板 DNA 及数字 PCR 反应预混液混合，形成 PCR 反应体系。体系分布到 10000-20000 个微滴中，使大部分微滴中的模板 DNA 分子数量为 1 或 0，然后进行 PCR 扩增。GroEL 基因探针 5'端标记 FAM 荧光，数字 PCR 系统检测每个微滴的荧光信号，阳性微滴信号增强，根据阳性微滴数量判定样品是否含有溶藻弧菌。 6 主要设备及耗材 6.1 天平：感量 0.1 g 6.2 均质器 6.3 恒温培养箱：36℃±1℃ 6.4 高速台式冷冻离心机：离心力 12000 g 6.5 涡旋振荡仪 6.6 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计 6.7 生物安全柜 6.8 ddPCR 扩增仪及配套设备 6.9 不同量程移液器 6.10 离心管：2 mL、1.5 mL 和 0.2 mL 7 材料与试剂 7.1 分析纯试剂和符合 GB/T 6682 的一级水 7.2 细菌基因组提取试剂盒 7.3 ddPCR 反应配套试剂 7.4 去游离核酸酶 7.5 阳性对照：溶藻弧菌标准菌株 DNA 或含目的片段的 DNA 7.6 溶藻弧菌 GroEL 基因特异性序列片段及引物探针（附录A）： - VA-F: 5'-GAGCTTTCTGTTGAATGTAACGACAC-3' - VA-R: 5'-ACCCACACGCTCCATTGC-3' - VA-P: FAM-TCTCTGCAAACTCAGACGCAAGCGTAGG-BHQ1-3' 8 检测程序 食品中溶藻弧菌 ddPCR 检测步骤见附图。提供信息仅为使用参考，等效产品可替代。