【SN商检标准】 出口食品中致病菌检测方法微滴式数字PCR法第⒉部分:霍乱弧菌

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T5364.2—2021 出口食品中致病菌检测方法 微滴式数字PCR法 第2部分：霍乱弧菌 Droplet digital PCR method for detection of pathogens in export food - Part 2: Vibrio cholerae 中华人民共和国海关总署 发布 2022-06-01 实施 前言 本文件按照 GB/T1.1-2020 《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》起草，由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件为 SN/T5364—2021《出口食品中致病菌检测方法 微滴式数字PCR法》第2部分，涉及霍乱弧菌检测。本文件起草单位包括中国海关科学技术研究中心、天津海关、中国检验检疫科学研究院。主要起草人：魏海燕、马丹、魏咏新、李丹、张西萌、徐蕾蕊、刘莉、曹佳悦、曾静、董志珍、邢任歌、赵良娟、高飞。 1 范围 本文件规定了出口食品中总霍乱弧菌和含毒力基因霍乱弧菌的微滴式数字PCR检测方法，适用于食品中霍乱弧菌及含毒力基因霍乱弧菌的快速定性检测。检出限为1 CFU/25 g～5 CFU/25 g（或1 CFU/25 mL～5 CFU/25 mL）。 2 规范性引用文件 下列文件通过文中规范性引用构成本文件条款： - GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 - GB/T 27403-2008 实验室质量控制规范 - SN/T 1022 进出口食品中霍乱弧菌检验方法 注：带日期的文件仅该版本适用，未注日期的文件适用最新版本及其修改单。 3 术语和定义 本文件无特定术语需界定。 4 缩略语 DNA（deoxyribonucleic acid）：脱氧核糖酸 ddPCR（droplet digital polymerase chain reaction）：微滴式数字PCR gbpA（GlcNAc-binding protein gene）：N-乙酰葡糖胺结合蛋白A的编码基因 PCR（polymerase chain reaction）：聚合酶链式反应 tcpA（toxin coregulated pilin gene）：毒力协同调节菌毛编码基因 5 方法原理 针对霍乱弧菌种属特异性 gbpA 基因及毒力基因 tcpA 设计引物和探针，将一定浓度的引物、探针与模板 DNA 及数字 PCR 反应预混液混合，形成双重数字 PCR 反应体系。体系分布到 10000～20000 个微滴中，使大部分微滴中模板 DNA 分子数量为 1 或 0，然后进行 PCR 扩增。gbpA 基因和 tcpA 基因探针 5'端分别标记 FAM 和 VIC 荧光，数字 PCR 系统双通道检测，可同时采集分析两个基因的荧光信号，根据阳性微滴判断样品中是否含霍乱弧菌及含毒力基因霍乱弧菌。 6 主要设备及耗材 6.1 天平：感量 0.1 g 6.2 均质器 6.3 恒温培养箱：36℃±1℃ 6.4 高速台式冷冻离心机：离心力 12000 g 6.5 涡旋振荡仪 6.6 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计 6.7 生物安全柜 6.8 ddPCR 扩增仪及配套设备 6.9 不同量程移液器：100 μL～1000 μL、20 μL～200 μL、10 μL～100 μL、0.5 μL～10 μL 6.10 离心管：2 mL、1.5 mL 和 0.2 mL 7 材料与试剂 7.1 分析纯试剂和符合 GB/T 6682 的一级水 7.2 细菌基因组提取试剂盒 7.3 ddPCR 反应配套试剂 7.4 去游离核酸酶 7.5 阳性对照：霍乱弧菌参照菌株 DNA 或含目的片段的 DNA 7.6 霍乱弧菌 N-乙酰葡糖胺结合蛋白A 编码基因（gbpA）序列片段及引物探针（附录A）： - gbpA-F: 5'-CAAACCAAACTGGAACCCAAA-3' - gbpA-R: 5'-[序列略]-3' - 探针：5'-[序列略]-BHQ1-3' 8 检测程序 食品中霍乱弧菌 ddPCR 检测步骤参见附图，提供信息仅作使用参考，等效产品可替代。