【商检行业标准(SN)】 进出口贝类中腹泻性贝类毒素检测方法 第1部分：荧光磷酸酶抑制法

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T2131.1—2008
进出口贝类中腹泻性贝类毒素检测方法第1部分：荧光磷酸酶抑制法
Determination of DSP in shellfish for import and export-Part 1:Inhibition method of fluorescence phophatase activit2008-09-04发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2009-03-16实施
本部分是SN/T2131的第1部分。
本部分的附录A为规范性附录。
本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局。本部分主要起草人：吴斌、李叶、王玉萍、李振荣、谢炎本部分系首次发布的出入境检验检疫行业标准YKANiKAca-
SN/T2131.1—2008
1范围
进出口贝类中腹泻性贝类毒素检测方法第1部分：荧光磷酸酶抑制法
SN/T2131.1—2008
SN/T2131的本部分规定了贝类中定量检测腹泻性贝类毒素的荧光磷酸酶抑制检验方法。本部分适用于双壳类贝肉、贝柱中的大田软海绵酸及其衍生物的检验。2缩略语
下列缩略语适用于SN/T2131的本部分，2.1
DSPdiarrheicshellfishpoisontoxin腹泻性贝类毒素。
Okadaic acid
大田软海绵酸。
大田软海绵酸族衍生物。
3样品保存与制备
3.1样品的保存
如实验室不能立即检验，应分别用标签注明来源、取样日期、品种及编号，装塑料袋密封。抽样后样品应立即于一18℃以下冷冻保存3.2样品的制备
用清水彻底洗净待检贝壳，打开贝壳，彻底清洗贝壳内部，除去内部污质，取出所有贝肉组织，用滤纸尽量吸干贝肉组织的多余水分，待检贝肉组织不得少于50g。4测定方法
4.1方法提要
本方法的测定原理是大田软海绵酸（Okadaicacid,OA)及其衍生物(DTXs)的毒性与它们抑制丝氨酸和苏氨酸磷酸酶蛋白的活性直接相关，特别是PP1和PP2A两种蛋白；在磷酸酶及其荧光酶作用物的微孔板实验中，大田软海绵酸及其衍生物的浓度直接决定了磷酸酶水解荧光酶作用物的能力，水解后荧光酶作用物产生荧光，然后通过荧光酶标仪读取荧光值，样品中毒素的浓度可以通过标准曲线计算得出。
4.2试剂和材料
除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水为去离子水4.2.1100%（体积分数）甲醇。
4.2.22.5mol/L的氢氧化钠溶液：100g氢氧化钠溶解于500mL水中，定容至1000mL。4.2.32.5mol/L的盐酸溶液：205mL浓度为37%（体积分数）的盐酸加人400mL水中，定容1
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至1000mL
4.2.496孔微孔板（12×8）。
4.2.5磷酸酶溶液：见附录A第A.1章。-TTKAONKAca-
4.2.6大田软海绵酸标准品：0nmol/L，0.5nmol/L，1nmol/L，1.5nmol/L，2nmol/L和3nmol/L。4.2.7荧光酶作用物：见附录A第A.2章。4.2.8磷酸酶稀释缓冲溶液。
4.2.910mmol/L的三（羟甲基）氨基甲烷-盐酸缓冲溶液（Tris-HCI)：见附录A第A.3章。4.3仪器和设备
4.3.1微量移液器：100μL或者200μL可调移液器，以及1000μL可调移液器。4.3.2旋涡混匀器。
4.3.3培养箱或者加热块：37℃土2℃。4.3.4荧光酶标仪：360nm土15nm激发波长，455nm±20nm发射波长4.3.5水浴锅：76℃±2℃。
4.3.6分析天平：0.01g感量。
4.3.7冰箱:2℃～8℃和15℃～-20℃。4.3.8灭菌玻璃器具：20mL和250mL的量筒，1000mL容量瓶。4.3.950mL带螺旋盖离心管。
4.4测定步骤
以下过程不可以使用微孔板振荡器。4.4.1提取：捣碎贝肉组织，称取5g到50ml.离心管，加25ml浓度100%的甲醇，用旋涡均质2min，在4℃下离心10min（2000r/min）.上清液（甲醇萃取液）倒人新离心管。4.4.2水解：取0.640uL的上清液（甲醇萃取液）到另二个离心管，加100μL的2.5mol/L的氢氧化钠.密封后在76℃±2℃中加热40min，再加80μL的2.5mol/L的盐酸，然后加浓度为10mmol/L的三（羟甲基）氨基甲烷-盐酸缓冲溶液（4.2.9)直到为20mL,待检。4.4.3加样：准备好所需要的96孔微孔板（4.2.4），建议样品和标准品都做2个～3个平行，旋涡均质标准品后，取制备好的待检样及标准品各50μL分别加入相应的检测小孔；立即添加70μL的磷酸酶溶液（4.2.5）到每个小孔；用粘胶纸密封，轻微振荡混合，4.4.4孵育：在37℃±2℃孵育20min±0.5min。4.4.5酶反应：加80μL的荧光酶作用物（4.2.7)到每个小孔，用粘胶纸密封，轻微振荡混合。4.4.6孵育：在37℃±2℃孵育30min±0.5min。4.4.7读数：揭开密封粘胶纸，读取样品和标准品荧光光度值：激发波长：360nm士15nm；发射波长：455nm±20nm。
5结果计算与报告
5.1计算抑制率
样品和标准品的荧光值对比第6个标准品（即阴性标准孔）荧光值，按式（1）可以计算出样品及标准品的酶活性抑制率：
A）×100
抑制率(%)=(1-
式中：
A一样品或者标准品的荧光值；
A。阴性质控的荧光值（即0μg/kg标准品）。2
...(1)
5.2标准曲线绘制
SN/T 2131.1—2008
在对数坐标纸上将样品、标准品的酶活性抑制率设为X轴，大田软海绵酸浓度的对数值设为Y轴，可得到标准曲线（见图1）。
(1/aum)/
注：R2应大于等于0.96。
5.3计算公式
yo.34ec.an.r
253035
标准品的酶活性抑制率/%
图1标准曲线
样品中OA浓度（c.）可以通过上面的校准曲线计算出，也可通过式（2)计算出：y=aEXP(bx)
式中：
X样品的磷酸酶活性抑制率；
甲醇抽提溶液中OA浓度（c）；
一对数（log）。
示例：
5.4结果计算
y=0.34EXP(0.05x)
根据式（3)计算出样品中腹泻性贝类毒素的浓度：G =GXFDX MW×V
式中：
组织样品中腹泻性贝类毒素的浓度，单位为微克每千克（μg/kg）；甲醇抽提溶液中腹泻性贝类毒素的浓度，单位为纳摩尔每升（nmol/L）：FD
甲醇抽提溶液稀释因子（例如：20÷0.64=31.25）；大田软海绵酸的相对分子质量（805），单位为克每摩尔（g/mol)；甲醇抽提溶液的体积（0.025L）.单位为升（L）)样品重量（5g），单位为克（g）。示例：1.5nmol/L浓度的0A标准品结果为：1.5nmol/L×31.25×805g/mol×0.025L/5g-189μg/kg(2)
（3）
若样品的OA浓度在标准区间外时（<5nmol/L或者>3nmol/L），结果则报告为<0.5nmol/L（或者<63μg/kg)或者>3nmol/L（或者>377μg/kg）。3
SN/T2131.1—2008
A.1磷酸酶溶液的配制
附录A
（规范性附录）
标准试剂配制
IIKAONT KAca
此溶液配制后应立即使用加2mL的磷酸酶稀释缓冲溶液（4.2.8）至冻干的磷酸酶（4.2.5）试剂瓶中，轻微振荡使其溶解（不可以激烈振荡，避免蛋白聚合）。在室温（22℃土2℃）下放置30min·使磷酸酶充分水解，在任何时候都不可以使用旋涡，每瓶试剂足够24个孔使用，如果需要检测更多的样品，则需准备足够多试剂，振荡混合后一起倒入酶标槽中待用。A.2荧光酶作用物的配制
加3mL浓度为10mmol/L的三（羟甲基）氨基甲烷-盐酸缓冲溶液（4.2.9)到荧光酶作用物(4.2.7)试剂瓶中，混合均匀：每瓶试剂足够37个孔使用，如果需要检测更多的样品，则需准备足够多试剂，振荡混合后一起倒人酶标槽中待用。试剂应避光，可以用铝薄纸包装的容器来放置。A.3三（羟甲基）氨基甲烷-盐酸缓冲溶液（Tris-HCI)的配制（浓度为10mmol/L）取20mL浓度为100mmol/L的Tris-HCI缓冲溶液（4.2.9）溶解到180mL的水中（分别使用不同量筒），实验时保持4℃～8℃，非实验时保持室温ThispartwasSN/T2131part one
Foreword
TheappendixAofthispartwasnormativeSN/T2131.1—2008
Thispart was released upon approval of theGeneral Administration of Quality Supervision,Inspec-tionandQuarantineof thePeople's of China.Thispart wasdrafted byLiaoning Entry-ExitInspectionandQuarantine Bureauof thePeople'sRepublic of China.
ThispartwasmajordraftedbyWubin,Liye,WangYuping,LiZhenrong.Xieyan.This part is promulgated for the first timeSN/T2131.1—2008
-TKAONiKAca-
Determinationof DSP inshellfishforimport and exportPart 1:Inhibitionmethodoffluorencephophataseenzyme activity
SN/T2131thispartspecifiesamethodforthequantitativedeterminationofdiarrheicshellfishtoxinsinshellfishspeciessuchasmussels.clams,oystersandscallops.etc.This part refers to test diarrheic shellfish toxins including OA and other carboxylic toxins of the OAgroup includingDTX1.DTX2,DTX2Bandtheiresterforms(DTX3)in shellfishspeciessuchasmus-selsclams.oystersandscallops.etc2Abbreviated words
ThefollowingAbbreviated words shall applyinSN/T2131thisstandard:2.1
diarrheic shellfish poison.
OA okadaic acid.
Dinophysistoxins
Samplingandsamplepreparation3
3.1Samplestorage
If samples can'tbe inspected in lab intime.they shouldbeenput into theseal pouchandthen frozenandstoredatbelow-18aftertheyarenoted sources,samplingdate.species.numberwithlabels.3.2Samplepreparation
Clean the shell thoroughly using water; open the shellfish; and wash inside the shell thoroughly toget rid of any dirt.Remove the tissue inside the shell by cutting all the muscles attached to the shellPlace the shellfishtissue ina filter paper forfew minutes to remove water in excess.The weight of6
samplescannotbelessthan50g
Assaymethod
4.1Principle
SN/T2131.1—2008
The toxicity of OA and DTXs is directly related to their inhibitory activity against a family of struc-turallyrelated serine/threonineproteinphosphatases(PP),inparticularPP1andPP2A.Thisstrong in-hibitory property is used to determine OA content in shellfish by means of a microplate assay usingthe enzyme PP and a fluorogenic substrate for this enzyme. The enzyme hydrolyses the fluorogenicsubstrate and the product can be measured by fluorescence using a microplate reader.As the abilityof the PPtohydrolysethefluorogenic substrate dependson the presenceof OA and analogues in thesamples,thetoxin concentration can be calculated byusingastandard curve.4.2Reagent
All reagents areanalytical andwateris deionisedunless otherwise specified.Methanol solution:100%(V/V)
2.5 mol/L NaOH solution:Add 100 gof NaOHto 500 mL water and dissolve.Transfer toa4.2.2
volumetricflaskandadddeionisedwaterforafinalvolumeof1oo0mL.4.2.32.5 mol/L HCl solution:Take 205 mL of HCl(37 % V/V)using a volumetric cylinder of500 mLandaddwithcautionto400mLof distilled wateralreadycontained ina volumetricflask.Mixand add deionised water for a final volume of 1 000 mL.4.2.496 wells microtiterplate (12 strips of 8 wells).4.2.5
Phosphatasesolution:SeeappendixA.1.Okadaicacidstandards:(0.0.5.1.1.5.2and3nmol/L)Fluorogenicsubstrate:SeeappendixA.2Phosphatasedilutionbuffer
Tris-HClbuffersolution(10mmol/L):SeeappendixA.34.3Instrumentand equipment
Micropipettes:Adjustable100μLor200μLpipettesand an adjustable1000μLpipette7
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Vortex
Incubator or block beater for 37 ℃ ±2 ℃.-IIKAONT KAca-
Fluorescentmicroplatereader:360nm±15nmexcitationwavelengthand455nm±20nm4.3.4
emissionwavelength.
Waterbathat76℃±2℃.
Analyticbalance:0.01greciprocalsensibility4.3.7
Refrigerator:2℃~8℃ and-15℃~-20℃.Sterilizingglassware:20mLand250mLcylinder,1000mLvolumetricflaskGraded50mLcentrifugetubeswithscrewcaps4.4Assayprocedure
Do not use a plate shaker at any time.4.4.1
Extraction:Mashthe shellfishtissueand weigh5gat50mLcentrifugetubes.Add25mLof100%(V/V) Methanol and homogenise the mixture for 2 min using a tube shaker. Centrifuge at2 000 r/min for 10 min at 4 ℃.The supernatant(methanolic extract)ispoured into a centrifuge tube4.4.2Hydrolyzation:Take 0.640 μL of methanolic extract and poor into another centrifuge tube,add100μLof2.5mol/LNaOH;Sealandheatat76℃±2℃for40min.Add80μLof2.5mol/LHClThe sample does not need to be cooled down;Add up to 20 mL of 10 mmol/L Tris-HCI buffer solution(see 4. 2.9).
4.4.3Add reagent:Takethestrips(see4.2.4)that theassay need totestfrom frame,samples andstandards is suggested to analyse in duplicate or triplicates.For thispurposeadd 5o μL of the sam-ples and standards to relevant wells individually;add 70 μL of phosphatase solution(see 4.2.5)toeach well immediately,cover the plate with the adhesivefilm provided and mixby gentle tapping onthe side.
4.4.4Incubation:Incubate at 37℃ ±2 ℃ for 20 min±0.5 min.4.4.5
Substrate reaction:Add 80 μL of fluorogenic substrate(see 4.2.7)to each well and mixbytapping gently on the side. Cover the plate with the adhesive film.Incubation:Incubateat37℃±2℃for30min±0.5min.4.4.6
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4.4.7Reading:Remove the adhesive film and read fluorescence of samples and standards:Excita-tionwavelength:360nm±15nm,Emissionwavelength:455nm±20nm.Graphicrepresentationandcalculationof results5
CalculateInhibition
Calculatethe inhibition(%)of the enzyme activityfor each sampleand standardby comparingtheseto the standard 6(first standard0 μg/kg of OA).Inhibition(%）=
AArbitraryfluorescenceunitsforsamplesorstandards;A。Arbitraryfluorescenceunitsforthenegativecontrol(oμg/kgstandard)5.2
Obtainastandardcurve
Plot the inhibition(%)in a linear X axis and the concentration of okadaic acid in alogarithmic Yaxisandusealogarithmicfittingas shownseefigure1.F=D.3406.55
(uuu>/vo
15 20
Inhililicn/(o)
Note:TheR2hastobehigherthan orequal too.96.35
Figure1Logarithmicfittingofthestandard curve5.3
Formulation
The OA concentration contained in the sample(c)is calculated by interpolation into the calibrationcurve orusingthefollowing equation(2):y=aEXP(bx)
（2）
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y value is the OA concentration in the sample(c.);thexthe%of inhibition of thesample;EXP means logarithm.
example：y=0.34EXP(0.05x)
Calculation
Calculatethediarrhoeicshellfishtoxins(DSP)concentrationintissueasfollow(3):C: = C. × FD × MW × V。
Diarrhoeictoxinconcentrationintissue.μg/kgCt
CsDiarrhoeictoxinconcentrationinsample.nmol/L;FDMethanolicextractdilutionfactor(i.e.20/0.64=31.25)；MW-Okadaicacidmolecularweight(=805)，μg/mol;V。Methanolic extract volume (0.025 L),L;mtTissueweight(5g).g
Example：1.5nmol/L×31.25×805g/mol×0.025L/5g=189μg/kg-TiKANiKAca-
For samples with a toxin concentration outside the range of the calibration curve(3nmol/L),resultswillbereportedas<0.5nmol/L(or<63μg/kg)or>3nmol/L（or>377μg/kg)10
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