【商检行业标准(SN)】 进出口动物源性食品中β-内酰胺类药物残留检测方法 微生物抑制法

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T2127—2008
进出口动物源性食品中-内酰胺类药物残留检测方法
微生物抑制法
Determination of β-lactam residues in foodstuffs of animal origin forimport andexport-MIA method
2008-09-04发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2009-03-16实施
本标准的附录A为规范性附录。
本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。iiKAoNaiKAca-
SN/T2127—2008
本标准起草单位：中华人民共和国福建出人境检验检疫局、中华人民共和国珠海出入境检验检疫局。
本标准主要起草人：郑晶、黄晓蓉、吴谦、冯家望、翁国柱、张体银、郑麟毅、吴芸芸。本标准系首次发布的出入境检验检疫标准。I
1范围
进出口动物源性食品中β-内酰胺类药物残留检测方法微生物抑制法
SN/T2127—2008
本标准规定了动物源性食品中β-内酰胺类药物残留检测的试样制备、保存和微生物抑制检测方法。本标准适用于牛奶、肉类、鱼和虾中的芒青霉素、氨芒青霉素、羟氨苄青霉素、邻氯青霉素、双氯青霉素、苯唑青霉素和头孢噻等药物残留筛选检测，阳性结果应用其他方法进行确证。2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T66822008.ISO3696：1987.MOD）3试样制备和保存
3.1试样制备
3.1.1牛奶：取不少于500mL试样，装入清洁容器内，并标明标记3.1.2肉类、鱼和虾：从原始样品中取出部分有代表性样品，将可食部分放入高速捣碎机均质，充分混勾.用四分法缩分不少于500g试样。装人清洁容器内，并标明标记。3.1.3制样操作过程中，应防正样品受到污染或发生残留物含量的变化3.2试样保存
3.2.1牛奶：0℃～4℃保存。
3.2.2肉类、鱼和虾：试样于一18℃以下保存，新鲜或冷冻组织样品可在2℃～6℃保存72h4测定方法
4.1方法提要
试样经缓冲液提取、温育和离心后，取上清液进行测定。利用抗生素对敏感菌的抑制作用来判别试样中是否含有抗生素。
4.2设备和材料
4.2.1恒温箱：63℃±1℃。
4.2.2离心机。
4.2.3高速组织捣碎机。
4.2.4恒温水浴锅：80℃。
5涡旋振荡器。
显微镜：10×100×。
游标卡尺：测量范围0mm~200mm，精度0.02mm或抑制圈测量仪4.2.8
3灭菌平血：直径90mm，底部平整的玻璃或一次性塑料灭菌平血。圆形滤纸片：直径10mm，厚1.1mm。日本ToyoRoshiKaishaLtd.产品或同类产品4.2.9
4.2.10克氏瓶。
SN/T2127—2008
4.2.11可调移液器：10μL~100μL,100μL~1000μL。4.3菌种和培养基
4.3.1菌种
嗜热脂肪芽孢杆菌BacillusstearothermophilusATCC101494.3.2培养基
4.3.2.1细菌保存培养基：见附录A第A.1章。4.3.2.2菌种芽孢培养基：见附录A第A.2章。4.3.2.3检定培养基：见附录A第A.3章。4.4试剂
除非另有说明，本标准所用化学试剂均为分析纯，试验用水应符合GB/T6682的规定。4.4.11.0mol/L盐酸溶液
量取90mL浓盐酸用蒸馏水稀释至1000mL。4.4.21.0mol/L氢氧化钠
准确称取4.0g氢氧化钠，溶解于100mL蒸馏水中。4.4.3缓冲液
TKAONTKAca-
4.4.3.1pH6.0磷酸盐缓冲液：称取8.0g磷酸二氢钾（KH2PO4）及2.0g磷酸氢二钾（K2HPO4：3H20)，用蒸馏水溶解并定容至1000mL.121℃高压灭菌15min。4.4.3.2磷酸盐缓冲液-丙酮
磷酸盐缓冲液-丙酮：按体积比pH6.0磷酸盐缓冲液：丙酮=1：1比例制备。4.4.4：抗生素标准液
4.4.4.1标准品：苄青霉素，纯度≥99%。4.4.4.2芊青霉素标准储备液：准确称取适量的青霉素标准品，用灭菌pH6.0磷酸盐缓冲液（4.4.3.1）溶解并定容至1000μg/mL，置2℃~8℃冰箱保存，贮存期7d4.4.4.3芋青霉素标准工作液：吸取适量的苄青霉素标准储备液.用pH6.0磷酸盐缓冲液（4.4.3.1）稀释成0.005ug/mL的标准工作液，应当日配制使用。4.5测定步骤
4.5.1样液提取
4.5.1.1牛奶：取20mL鲜奶于50mL离心管，3000r/min离心5min，除去上层脂肪层，以1.0mol/L盐酸溶液或1.0mol/L氢氧化钠调节pH至6.5～7.0。脱脂奶可直接用于检测。4.5.1.2肉类、鱼和虾：称取10.0g均质好的试样于50mL离心管中，加人磷酸盐-内酮缓冲液10mL，用涡旋振荡器充分振荡3min，于80℃水浴保温30min后，3000r/min离心15min取上清液作为样液。
4.5.2菌悬液的制备
嗜热脂肪芽孢杆菌ATCC10149菌悬液：一般情况下，菌种的传代次数不应超过5代，否则在每次使用前确证其生化特性没有发生变异，或另需购置新的标准菌株。在确定保存的菌种生化特性没有改变后，将复活的菌种分别接种于盛有增菌用固体培养基的克氏瓶中，55℃士1℃培养72h镜检芽抱数达80%以上（如果达不到，可再培养数日，芽孢数仍达不到要求，菌种可能变异，不可使用），用灭菌生理盐水洗下菌苔，使其悬浮于生理盐水中，80℃水浴加热30min，经3000r/min离心20min，弃去上清液，如此重复洗涤芽孢两次。然后用适量灭菌生理盐水制成菌悬液.用稀释平板计数的方法或比浊法进行计数以确定菌种的浓度。置2℃～8℃冰箱保存，贮存期30d。4.5.3检定用平板的制备
将试验菌悬液按一定的比例加人到融化后冷却至60℃左右的灭菌检定培养基中充分混勾后，使平板中的嗜热脂肪芽孢杆菌的浓度达到1.0×106CFU/mL。在灭菌平皿中加入6mL混合液，保持水平2
SN/T2127—2008
待其凝固。取制备好的检定用平板两个，分别放置两个滤纸片，加人约90L（以纸片吸满为准）0.005μg/mL芊青霉素标准工作液，冷藏放置30min后，63℃士1℃培养3.5h能产生14mm以上清晰、完整抑菌圈的平板为合格，达不到要求的平板应弃去。制备好的平板置2℃～8℃冰箱可保存2d~3d。
4.5.4测定
取制备好的检定用平板两个，在平板底部作好标记，将滤纸片适当间隔置于平板上，每个平板最多不超过6个，在其中一个滤纸片加人约90μuL（以纸片吸满为准）0.005μg/mL苄青霉素标准工作液作为阳性对照，其余的滤纸片中加入约90μL样液，冷藏放置30min后.63℃1℃培养3.5h后开始观察，如果0.005μg/mL芋青霉素标准工作液产生清晰、完整的抑菌圈且大于14mm时终止培养，记录标准工作液和样液的抑菌圈结果。每份样品做两个平板上的平行试验。4.6检测结果判断和报告
4.6.1如果样液在平板上无抑菌圈，0.005ug/mL芊青霉素标准工作液的抑菌圈直径大于14mm.即报告“阴性”。
4.6.2如果样液在平板上呈现抑菌圈，抑菌圈直径在13mm以上，即报告“初筛阳性”。4.6.3如果样液在平板上呈现抑菌圈，抑菌圈直径小于13mm，大于10mm，或者两个平行结果不一致时、视为可疑，应重新测试后判定。4.6.4阳性样品需要用确证方法进行定性及定量分析。5检测限
本标准的检测限见表1。
表1β-内酰胺类药物检测限
β-内酰胺类药物名称
芋青霉素
氨青霉素
羟氨青霉素
邻氯青霉素
双氯青霉素
苯唑青霉素
头孢噻呋
牛奶的检测限/（ug/kg）
肉类、鱼和虾的检测限/（ug/kg）20
SN/T2127—2008
细菌保存培养基
A.1.1成分
胰蛋白陈
植物蛋白陈
氯化钠
蒸馏水
pH7.3±0.2
A.1.2制法
1000mL
寸录A
（规范性附录）
培养基
将各成分加热溶解，分装试管，121℃高压灭菌15min，制成斜面。注：制成半固体时.琼脂量为0.5%。A.2
菌种芽孢培养基
A.2.1成分
胰蛋白陈
植物蛋白陈
氯化钠
磷酸氢二钾
蒸馏水
pH7.3±0.2
A.2.2制法
1000mL
将各成分加热溶解，分装300mL于克氏瓶内，121℃高压灭菌15min。A.3
检定培养基
A.3.1成分
牛肉膏
蛋白陈
大豆蛋白陈
葡萄糖
氯化钠
磷酸氢二钾
吐温-80
溴甲酚紫
蒸馏水
pH7.8±0.2
1000mL
-iikAoNiiKAca
A.3.2制法
0.6%漠甲酚紫溶液配制：称取0.6g溴甲酚紫溶于100mL蒸馏水中。SN/T 21272008
将各成分加热溶解，分装每瓶100mL，每瓶中加人0.6%漠甲酚紫溶液1mL，121℃高压灭菌15 min。
SN/T2127—2008
Foreword
AnnexAofthisstandardis normativeannexeiiKAoNiKAca
This standard was proposed byand is underthe jurisdiction of Certificationand AccreditationAdmin-istration of the People's Republic of China.This standard is drafted by Fujian Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau and Zhuhai Entry-ExitInspectionandQuarantineBureauof thePeople'sRepublicofChina.Maindrafterof thisstandardareZhengJing.HuangXiaorong,WuQian,FengJiawang,WengGuozhuZhang Tiyin,Zheng Linyi and Wuyunyun.This standard is aprofessional standard for Entry-Exit inspection andquarantinepromulgated forthefirsttime.
SN/T2127—2008
Determination of β-lactam residues in foodstuffs ofanimal origin for import and export-MlA methodScope
This standard specifies the sample preparation.preservation and microbial inhibition assay methodfordetection of β-lactam residues in foodstuffsof animal origin.This standard is applicable to the screening inspection of Benzyl penicillin.Ampicillin.Amoxicillin.Cloxacillin,Dicloxacillin,Oxacillin and Ceftiofur residues in milk,meat,fish and shrimp.Any positiveresultshouldbeconfirmedbyothermethod.2NormativeReference
The following normative documents contain provisions which,through reference in this text,consti-tute provisions of this standard.For dated reference,subsequent amendments to (excluding editingcorrections),orrevisions of,anyof these publications do not apply.However.partiestoagreementsbased on this standard are encouraged to investigate thepossibility of applying the most recent edi-tions of the standards indicated below.For undated references,the latest edition of the normativedocument referred to applies.GB/T6682Waterforanalytical laboratoryuse—Specifications andtestmethod(GB/T6682-—2008ISO3696：1987MOD）
SamplePreparationandStorage
3.1SamplePreparation
Milk:Take the sample not less than 500 mL,place the reduced sample into a clean containerand mark the container.
3.1.2Meat,fish and shrimp:Take a representativepart from the original sample. Place the edibleportion inhigh-speedtissue blendertohomogenizeandblendthesamplethoroughly.Reduce sizeofthe sample to not less than 500 g with quarter dividing method. Place the reduced sample into a cleancontainerandmarkthecontainer.3.1.3
Whenpreparing samples,measuresshould be takento preventsample frombeing contami-SN/T2127—2008
natedorcontentof residuebeingchanged.3.2
SamplePreservation
Milk:Stored at0℃~4℃.
-TKAONKAca-
Meat,fishor shrimp:Storedat-18℃orbelow.Freshandfrozentissuesamplescanbestoredat2℃~6℃forupto72h.
AssayMethod
Brief Introduction
Test sample is distilled with buffer solution,incubated and centrifuged. Take supernatant for test.Utilize the inhibiting effect of antibiotics on sensitive bacteria to determine if there are antibiotics inthetest sample.
EquipmentsandMaterials
Incubatorsetat63℃±1℃
Centrifuge.
High-speed tissue blender.
Water bath:80℃.
Vortexmixer.
Microscope:10×~100×.
Vernier caliper,0 mm~200 mm range,with a precision of 0.02 mm or inhibiting circleSterilizedPetridishes:90mmdiameterglassorplasticwithflatandsmoothbottomFilterpaperdisk,1ommdiameter.1mmthickness.ProductofToyoRoshiKaishaLtd.Japanorequivalent.
Kolleflask.
Finnpepette:10μL~100μL,100μL~1000μL4.3ReagentsandSupplies
Bacteria
BacillusstearothermophilusATcc101494.3.2
SN/T 2127—2008
Mediaforpreservationandtransportationofbacteria:RefertoAnnexA.1.Liquid Media for reproduction of bacteria:Refer to Annex A.2Mediaforbioassay：RefertoAnnexA.3.4.4Reagents
All chemical reagents used in this method are of analytically pure. Test Water should be distilled wa-terordeionizedwater inconformitywithGB/T6682.4.4.11.0mol/LHCl
Dilute90mLof concentrationHCIto1000 mLwith distilled water.1.0mol/LNaOH
Dissolve4.0gNaOHin100mLofdistilledwater.4.4.3
Buffer Solutions
4.4.3.1pH6.0phosphatebuffer:Weighout8.0gpotassium dihydrogenphosphate(KH2PO4)and2.0 g dipotassiumhydrogenphosphate(K2HPO4·3H2O),dissolve inand bring the volumeof the solutionto1000mLwithdistilledwater.Autoclaveat121℃for15min.4.4.3.2
Phosphatebuffersolution-AcetonePhosphatebuffersolution-Acetone:Mixed pH6.0 phosphate buffer and acetone in a ratio of 1:1.4.4.4Antibiotic reference solutions4.4.4.1
Benzylpenicillinstandard:Purity≥99%.Benzylpenicillinreferencestocksolution:Weighouta certainquantityof benzylpenicillin,9
SN/T2127—2008
-iiKANiKca-此内容来自标准下载网
dissolve in and bring the concentration to 1 000 μg/mL with pH 6.0 phosphate buffer(4.4.3.1). Thestock solution should be stored in refrigeratorat2℃~8and canbeused for7d.4.4.4.3Benzyl pencillin reference working solution:Pipette a certain volume of benzyl penicillinreferencestock solution,and dilute it to0.005μg/mLreferenceworkingsolutionwithpH6.0 phos-phate buffer (4.4.3.1).The working solution should be used in the same day of preparation.4.5AssayProcedure
Extractingsampleliquid
Milk:Take20mLmilk ina50mLcentrifugetube,centrifugeat3000r/min5min,removethefat on the superstratum.Adjust pHfrom6.5to7.0with1.Omol/LHClor1.Omol/LNaOH,exceptskimmilk.
Meat.fishor shrimp:Weighout10.0ghomogenized sampleand put it in a50mL centri-4.5.1.2
fugetube.Add10mLofphosphate-acetonebuffersolution.Vibrate invortexmixerfor3mintoen-sure thorough mixing.Incubate in waterbath at80 ℃ for30 min.centrifuge at3000r/min 15min,andthenpipettethesupernatantassampleliquid.4.5.2PreparingbacterialsuspensionsBacterial suspension of Bacillus stearothermophilus ATCC10149: Inoculate the resurgent bacteria inKolle flasks containing solid medium for reproduction respectively.Incubate at 55℃±1 for72 h.Perform microscopic examination to ensure a spore number of 80% or above (If not,incubate for acoupleof daysmore.Thebacteria maybedegenerateandshouldbediscarded if sporenumber stillnotmeetstherequirementafterincubationforseveraldays).Washthelawnsoutwithandletthemsuspending in sterile saline. Warm in waterbath at 80 ℃ for 30 min. And then:1. Centrifuge at3 000 r/min for 20 min. 2. Discard the supernatant. 3. Add sterile saline into the centrifuge tube. 4Repeat1to3twice.Add a suitable quantity of sterile salinetoprepare thebacterial suspension.Thesuspensioncanbestoredinrefrigeratorat2℃~8℃for30days.4.5.3Preparingbioassay plateAdd condignbacterial suspension with thebest concentrationtomediaforbioassaythat hasbeendissolved,autoclaved and cooled to about 60 ℃,and mix them well.Pour 6 mL of the inoculated agar into each plate.Keeptheplatehorizontal untiltheagar solidified.Fullinhibitingcirclesof 14mmdiametercanbeobtainedwith0.005μg/mLbenzyl penicillin referenceworking solution after incubated at63C ±1℃ for3.5h.Thepreparedplatecanbestored inrefrigeratorat2℃~8℃for2d~3d.4.5.4Performing thebioassay
Takeeach twoof the threekinds of plate.Mark the plates on thebottom surface.Placefilter paper10
小提示：此标准内容仅展示完整标准里的部分截取内容，若需要完整标准请到上方自行免费下载完整标准文档。