【商检行业标准(SN)】 李痘病毒检疫鉴定方法

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T2125—2008
李痘病毒检疫鉴定方法
IdentificationofPlumpoxvirus2008-09-04发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2009-03-16实施
本标准的附录A为资料性附录。
本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。iKAoNrKAca
SN/T2125—2008
本标准起草单位：中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院动植物检疫研究所、中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局本标准主要起草人：陈定虎、王章根、李明福、胡学难、李桂芬、王秀芬、冯黎霞、管维本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。1范围
李痘病毒检疫鉴定方法
本标准规定了李痘病毒检疫和鉴定的基本原则和方法。SN/T2125—2008
本标准适用于带有李痘病毒的所有进出境的无性繁殖材料、组培苗、种子和果实的检疫鉴定。2原理
李痘病毒学名：Plumpoxvirus(PPV），别名：Sharka virus，是核果类果树危险性最大的病毒之其外壳蛋白的特异性和核酸序列的特殊性是本标准制定的主要依据；该病毒的分类地位、地理分布、寄主范围和症状、传播途径、血清学特性及基因组特征等参见附录A。3仪器设备、用具及试剂
3.1仪器设备
酶标检测仪。
PCR扩增仪。
电泳仪。
台式高速冷冻离心机。
凝胶成像系统。
电子分析天平。
3.2用具
移液器(0.1μL~2μL.2μL～10μL,10μL~100μL,100μL~1000μL）。3.2.2研钵。
30.2mL、0.5mL、1.5mL离心管。3.2.4酶联板。
3.3ELISA检测试剂
3.3.1包被缓冲液1000mL(pH9.6）碳酸钠（NazCO）
碳酸氢钠（NaHCO）
叠氮化钠（NaN）
溶于1000mL蒸馏水中，溶液的pH为9.6，不需要调pH值。3.3.2PBS缓冲液1000mL(pH7.2~7.4）氯化钠（NaCI)
磷酸二氢钾（KH2PO）
磷酸氢二钠（NaHPO·12H,O）
氯化钾（KCI)
叠氮化钠（NaN,）
用无菌水溶解并定容至1000mL。3.3.3样品抽提缓冲液1000mL
二乙基碳酰二胺（DIECA)
PVP-10
SN/T2125—2008
用PBS缓冲液（pH7.2~7.4)溶解并定容至1000mL。3.3.4洗涤缓冲液1000mL
吐温-20
PBS缓冲液
无菌水
叠氮化钠（NaN）
3.3.5抗体稀释缓冲液
1XPBS缓冲液
0.5%牛血清白蛋白（BSA）
3.3.6底物缓冲液（pH9.8)1000mL二乙醇胺
加蒸馏水
叠氮化钠（NaN，）
用盐酸（HCI)调pH至9.8.然后定容至1000mL。3.3.7底物溶液
KANiKAca-
在底物缓冲液中加入碱性磷酸酶的底物对硝基苯磷酸钠（p-NitrophenylPhosphate.pNPP），浓度为1mg/mL。
3.4PCR检测试剂
3.4.1RNA抽提缓冲液
20 mmol/L Tris-HCl.pH8.0
1mmol/LEDTA.pH8.0
1%SDS.0.2%β-硫基乙醇
3.4.2TE缓冲液
10mmol/LTris-HCl.pH8.0
1mmol/LEDTA,pH8.0
3.4.3TAE缓冲液
40mmol/LTris-HAc
1mmol/LEDTA.pH8.0
3.4.46×加样缓冲液
漠酚蓝
3.4.5引物合成
根据已报道的PPV以及其D株系和M株系的保守序列设计通用和特异性引物：PPV通用引物：
Primer-1:5'-acc gag acc act aca ctc cc-3'Primer-2:5-cagactacagcctcgccaga-3PPV特异性引物：
D株系：
Primer-1:5'-acc gag acc act aca ctc cc-3PD:5'-ctt caa cga cac ccg tac gg-3M株系：
Primer-l:5'-acc gag acc act aca ctc cc-3\PM:5-ctt caa caa cgc ctg tgc gt-3'2
4检验方法
4.1症状检查
SN/T2125—2008
要仔细检查李属科植物叶片及其花、果实及种子是否有畸形、环斑、斑驳等可疑症状并采集可疑症状的样品。
4.2血清学检测
对采集的植物样品采用三抗夹心免疫吸附测定法（TAS-ELISA）进行检测，a）采取50mg表现可疑症状的植物组织，同时用50mg健康组织和组织提取缓冲液作为阴性对照，加入250μL样品抽提缓冲液研磨制成待测样品液；b）用包被缓冲液按要求稀释多克隆免抗PPV抗体，然后在酶联板的加样孔中加人90μL该稀释抗体，37℃保温4h；
然后用洗涤缓冲液洗涤酶联板3次，每孔加入洗涤缓冲液300uL，每次5min：d）取待测样品液90μL加入酶联板的加样孔中（以健康组织和植物组织抽提缓冲液作为阴性对照），4℃保温过夜（约8h）；
用洗涤缓冲液洗涤酶联板3次，每孔加入洗涤缓冲液300μL，每次5mine
每孔加入90uL合适稀释的第二抗体（单克隆PPV抗体），37℃孵育2h；f）
用洗涤缓冲液洗涤酶联板3次，每孔加人洗涤缓冲液300μL，每次5min；h)
每孔加人90μL合适稀释的碱性磷酸酶标记的羊抗鼠抗体，37℃孵育2h；用洗涤缓冲液洗涤酶联板3次，每孔加人洗涤缓冲液300μL，每次5mini）
j）每孔加人新配制的底物溶液90μL，然后在不同的时间分别测定它们的OD40snm吸收值。4.3植物组织总RNA提取
4.3.1选取0.1g表现可疑症状的植物组织同时用0.1g健康组织作为对照。将植物组织加液氮冷冻后充分研磨后装入1.5mLEppendorf离心管中。4.3.2在离心管中加入冰冷的400μLRNA抽提液，颠倒混合均匀。4.3.3台式冷冻离心机4℃12000g离心10min。4.3.4取上清液，加人400L苯酚-三氯甲烷-异戊醇（25：24：1，体积比），颠倒混合均勾。4.3.5台式冷冻离心机4℃12000g离心10min。4.3.6取上清液，加人400μL三氯甲烷-异戊醇（24：1.体积比），颠倒混合均匀。台式冷冻离心机4℃12000g离心10min。4.3.7
4.3.8取上清液加人1000μL无水乙醇和40μL3mol/L醋酸钠pH5.2.颠倒混合均匀。4.3.9台式冷冻离心机4℃12000g离心10min。4.3.10留沉淀，用500μL70%冷乙醇洗涤一次，置于超净工作台上吹干，然后溶于20uL无RNA酶的水中。
4.4RT-PCR检测
4.4.1RT：在0.5mL离心管中加人去离子水9.5μL，加人总RNA2μL.oligo（dT）150.5μL（0.5μg），dNTPs（10mmol/L）1μL，70℃水浴5min后立即置于冰上2min；然后3000r/min离心30s;再加人5XcDNA第一链合成缓冲液4μL，0.1mol/LDTT1μL;RNase抑制剂1μL（30U)；MMLV反转录酶1μL（20U)；37℃60min。4.4.2PCR扩增：在0.2mL离心管中加10×PCR扩增缓冲液2.5μL，氯化镁（25mmol/L)2μLdNTPs(10mmol/L)1μL,Primer-11μmol/L(50pmol),Primer-21μmol/L(50pmol)或PD(50pmol)或PM(50pmol），cDNA第一链合成反应液2μL，加水至25μL，然后加人Tag聚合酶0.5L（1U）。PCR循环条件：94℃变性3min；然后94℃40s，60℃40s，72℃1min，循环40次；最后72℃延伸10min；4℃保存反应产物。以健康植株总核酸和无菌水为阴性对照，PPVRNA为阳性对照。3
SN/T2125—2008
4.5琼脂糖电泳
KANiKAca
4.5.1用1×TAE缓冲液和琼脂糖按1.5%的浓度配好，在微波炉中熔化均匀，冷却至55℃左右。4.5.2加入SYBRGREENI核酸染料或溴化乙锭（1uμg/mL），混合均匀，倒人凝胶平台上，插上样品梳。
4.5.3待凝胶凝固后，拔出梳子，加入适量的TAE缓冲液（缓冲液没过凝胶上表面约1mm）4.5.4取1μL加样缓冲液与5μLPCR反应液混合均勾，然后分别将其和合适的DNA分子量标准物加入样品孔中。
4.5.5接通电源进行电泳，电压5V/cm。4.5.6当加样缓冲液中的溴酚蓝迁移至足够分离DNA片段时，停止电泳4.5.7将整个胶置于凝胶成像系统中观察，并照相记录。5结果判断
5.1血清学结果判断
5.1.1对照孔的OD405值（缓冲液孔、阴性对照及阳性对照孔），应该在质量控制范围内，即：缓冲液孔和阴性对照孔的OD405值小于0.15，当阴性对照孔的OD45值小于0.05时，按0.05计算：阳性对照OD405值/阴性对照OD405值大于5。5.1.2在满足了5.1.1质量要求后，结果判断如下：样品OD40值/阴性对照OD4os值大于等于2，判为阳性；样品OD4os值/阴性对照OD40s值小于2.判为阴性。
5.1.3若满足不了5.1.1质量要求，则不能进行结果判断。5.1.4如果是商品试剂盒，则根据试剂盒的说明来判断。5.2PCR结果判断
5.2.1当琼脂糖电泳时，如果阳性对照和待测样品都出现243bpDNA特异性条带而阴性对照没有条带，即可判定该样品带有李痘病毒，否则不带有李痘病毒5.2.2对于带有李痘病毒的样品，如果用Primer-1和PD二引物扩增出198bpDNA条带，则说明该李痘病毒为D株系；当用Primer-1和PM扩增出198bpDNA条带，则说明该李痘病毒为M株系。6样品保存与复核
6.1样品保存
检测为阳性的植物样品，经液氮冷冻后，于一80℃下保存。保存样品做好登记和标记工作，6.2结果记录与资料保存
包括：样品的来源、种类、采样时间、检测时间、地点、方法、结果等，并有实验人员的签字。ELISA要有实验数据结果，PCR要有电泳检测阳性结果照片。6.3复核
由国家质量监督检验检疫总局指定的单位或人员负责，主要考察实验原始数据记录及其电泳照片等资料的完整性和真实性，必要时进行复核实验。A.1李痘病毒分类地位
附录A
（资料性附录）
李痘病毒介绍
马铃薯Y病毒科（Potyviridae），马铃薯Y病毒属（Potyuirus）。A.2地理分布
SN/T2125—2008
保加利亚、罗马尼亚、阿尔巴尼亚、塞浦路斯、法国、德国、希腊、匈牙利、意大利、卢森堡、波兰、葡萄牙、西班牙、叙利亚、土耳其、英国、俄罗斯、埃及、智利及美国、加拿大、澳大利亚等国家。A.3寄主范围
PPV能侵染木本科和草本科寄主。李属植物是其自然寄主，最主要的自然寄主是刺李（Prunu：spinosa），其他如杏（PrunusarmeniacaL.）、桃（P.persicaL.）和日本的李子（P.domesticaL.）以及甜樱桃（P.aviumL.）和酸樱桃（P.cerasusL.）。菊叶香藜（Chenopodiumfoetidum）和克利夫兰烟（Nic-otianacleverlandii）通常作为草本指示植物。A.4寄主症状
A.4.1刺李（Prunusspinosa）和日本的李子（P.domesticaL.）：叶片上出现严重的扩散淡绿环或斑驳，果皮上出现深色的环，果肉出现红色或淡红色，果核带棕色斑点，大约有90%果实在未成熟前落果。A.4.2桃（Prunuspersica）、甜樱桃（P.aviumL.）和酸樱桃（P.cerasusL.）：叶片出现黄化叶脉、褪绿斑点和畸形，果皮出现散布的淡黄色斑点A.4.3杏（Prunusarmeniaca）：叶片出现散布的暗绿色斑和线，果实变形，果皮散布着坏死环.核上有黄色的环。
A.4.4菊叶香藜（Chenopodiumfoetidum）：当摩擦接种时，叶片上表现为枯斑症状。A.4.5克利夫兰烟（Nicotianacleverlandii）：经过摩擦接种时，全株表现为系统性侵染症状A.5传播途径
自然条件下由蓟短尾蚜（Brachycaudus），桃短尾蚜（B.helichrysi），忽布疣额蚜（Phorodonhumuli）和桃蚜（Myzuspersicae）作非持久性传播，并易经汁液接种传播；长距离扩散则主要靠感染病毒的植物繁殖材料的调运。
A.6血清学特性
PPV是良好的免疫原。根据血清学可将PPV划分为PPV-D(Dideron）、PPV-M(Marcus）、PPV-C（Cherry）、PPV-ElAmar四种血清型.其中D株系和M株系为最主要流行株系。A.7基因组特征
PPV基因为单分体基因组，含有一条正单链RNA分子，大小约10000核苷酸，其外面包被2000个均一的蛋白质亚基。RNA的5端为Vpg.3端为Poly（A）。基因组编码一个长的多聚蛋白，随后自身催化裂解产生10个产物：包括P1（N端蛋白，35.28KD），HC（蛋白酶辅助成分，52.25KD），P3（39.54KD），6K1CI（细胞质内含体蛋白，71：1KD），6K2，VPg（与基因组连接的蛋白，22.24KD），NIa（核内含体蛋白A，49KD.包括Vpg）.NIb（核内含体蛋白B.59KD，依赖于RNA的RNA聚合酶）以及CP(外壳蛋白：36.75KD)。
SN/T 2125-2008
中华人民共和国出人境检验检疫行业标准
李痘病毒检疫鉴定方法
SN/T2125—2008
中国标准出版社出版
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电话：6852394668517548
中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*
开本880×12301/16
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印张0.75
字数11千字
2008年11月第一版
：2008年11月第一次印刷
印数1—2000
书号：155066·2-19212
定价8.00元
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