【商检行业标准(SN)】 植物检疫玉米霜霉病菌检疫鉴定方法

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 11552003
植物检疫
玉米霜霉病菌检疫鉴定方法
Plant guarantineMethods for quarantineand identificatiun of Peronoscleraspora (lto] C, GShaw200211-25发布
中华人民共和国
国家质量蓝督检验检疫总属
2003-05-01实施
SN/T1155-2002
仅器和用具
试剂和材料
现场检疫与取扩
6实蜂室检验
了结果评定
5样品保存
附录A（资和性时录）
下米滑锦病菌寄主范围
谢录H资性影录）
DNA接取,扩增与电泳
附灵C规范性附录！CR扩增引物
对示D（蛋料性附录：玉米猪母病菌卵范子、分生子、分生孢严瘦所10
本标偏的附举C为规范性附录，附录A，附录B附录为资样性附录。本标循由国家认证认监督管理委贝会提出并归口。本标准起章羊位；中华人民共和国拓座出入境检验检疫局本标循兰要起单人李蕊裤、郭琼陈艳，张广志，张晓燕。本标准系背次发布的检验检疫行业标准，SN/T1156—2002
1范国
植物检疫
玉米精病菌检疫鉴定方法
本标准规定了核物检变中玉米粘需病检疫和鉴定方法。本标准适印于至米、甘能，高梁及其他寄土宁玉米需毒病菌的检疫利整定，2原理
SN/T1155—2002
下米辑宽病主要出高举霜每翁将（Prrumayelereporasorgt），廿熊君雾病（产，scchari)非伴克霜草疯国phiiensis霜缺病首（P.ma>dts）引起，该类病菌以下简称玉米需病菌Pereasere属粮z门Masin卵菌（Qayre）每月（Peroorporal变升a看指每（er），玉米带病莱险色击下米外还菜其栏物（参见阴减）。一股情况下正米需每病南非起系统性长染，有时也引起部轻来，变漫染的玉米片出现边界明显的失绿，后实形最势色坏死条斑。在温度17℃～29环境湿润杀件下，叶背面病斑长凸一层白色每状物，即玉米霜毒病菌分生抱子和孢子柜。该病分生孢了及孢了慢形态，分生抢一萌发情况，泡了形成情况、PCR持性反应等特街足下米来密病商鉴定特征。3仪器和用具
3. 1显疫统、体规显激镜。
3.2PCR仪，电脉议。
3.3冷冻高巡两心机，武微量高心机，3.4通冰箱.低源冰粘.恒温恒逗培养箱。35普通天平（感为1/100)，
3.迅净工作台
3.7谢益间样器
3.5Eppendnrf管(1.5ml...mL).DakRidge离心管（3uraL]3. 9试子扇头牙效：
3.1)截片完聚片，培血（直径沟15cm~20cm)：3. 11
报钠纸或arailm膜。
4试州和材料
4.1薪中基氧甚平烷（C,NO,
4.2二胺时2路CnH.N.0.
4.3一-统较链(tH)OS0N」
4.42-乙陈(CH,05)
4.5异为醇(CH,0)
4.5异或辟H.0)
4.7Z醇(GTE,CIIOHI)
4.8浪份益(C,3r.S
SN/T1155—2002
4.9监(HN,HE)
4.15t湖(CI.OH-CHOH-CHOH
4.11二甲苯苯胺(C,HmN)
4.12长C,H.
4.13Z销(ICO0Na)
（CHCK)
4. 15 三熟平烷(CHCL,)
41G氯化钢(Na)
氧化钾（KCI)
惠化镁MgCl.
内19室氧化钠（）
4.20种脱氧核苷=确酸(N1)
4.216gNA合
4. 22 恢核酸醇 RNasC A
4 23筷化Z(,Mr.I,B>
4.24扩物
4.25温-20
426琼脂构
4.27恋氧（N）
4. 28: kb 11NA 25 ng)
5现场拉疫与取样
5.1现场敏疫
现新核对货物有义单证，该实产地，包装、流头，品名及效具，你细检查逆境玉水需每病资主种子或原粮中是否夹带高翼、甘燕叶片病残体，尼否尖带带题壳的高采种了；检查进贷廿条和其使玉米恶非情菌寄三或叶片品否有可缺病逐，将检恢物一并带固实验室内放验。5.2原粮动种子欧样
2原始祥品私争会样晶制多
招微装逆境的1米粘每满函否主种予或原检，分解能、分层次.分品种按其盘式0个--50个点升版原始品，每份原始情品的点盘应不小十50为制成合样品，年份忘合样品的质想应不少15CeR-
其方式选竞的三文箱痒病离寄主种子或原粮，以车，车皮或其包装为单位托取！份复合排品，份名台年品的见策应不少一150061少于1500全形收样控验，其地也按本准积行。5.2.2船运散装原粮和税子的取祥饮鼓第·法取接，卸贫前在表层进行：第二次取样，卸货二分之一时进行；第二次取样，印装二分之二时茂行，每次收样各制各复合群品1份，52.3一设包装玉米范需病图潘主轴子或原接的职样份数和函量52.51取样份数
以x1:1g~0取2份1kg500kg取3份01kg~100kg取！1g下联-5g联份g以
上钙增1000塔最1份推触，不码0000g的余征，计取[给释点。52.3.2最样
采份样品成为250U，其他玉米霜病菌寄上每粉样品质量200g。2
5.3种菌，甘蓝插条取样
5.3.1取样份数
SN/T 1155—2002
100条（账）以下取1份，101条（抹）~500条（禁）取2份501条（）~-2000条（样）取3份20m条（长）~50G0条（煤）取4份：5301条（株）以上每增加5000条（株）增玻1份品，不足500柔（株）的余数计取1份样品，
5. 3. 2取样数量
廿带插条年份样品为10条，其他下米箔致病雷寄主种苗每份样品为21株。不足份样品数量的，：全部托样检验.
5.4样品竞记
折收样品必项登记，登记项月包拮能名及层次、发货继、源产地、品卡杆拦时间.样品编亏、托竹负姓名等，
6买验室检险
6.1源和种于洗激检验
将斗份表会样品充分微均，制成子均样品从各平均样品中称取508，骨卡250m=元瓶内，加人100mL素增水，件加性温-20：满~2滴，用组铂派或Paraim膜将三角瓶封口，在振离米上抵齿mitl将沈落缺移人离心肾，以：0)r/mi离心5mi：顿去上证费.再人利念忧涤总鼓，直至所有选浮液两心宽毕，用无萄水将沉旋物定落至1L~3ml，取价淀物基孕液至辑致片上，盖上益要片，开显微检查有无玉衣需病菌卵跑子，每批样品单少检查5个较片。如镜检发现卵拖子，可按第G.1.? 系行 PCR检制。
5.2寄主叶片和种子频壳等病残体检验6 2.1病斑检查
6.2.1.1病叶核查
在光线充足处，避片检查高梁，甘蔗等寄土片有无短色环死条状病斑。6.2.1.2离露种于预壳检查
在许现显截镜下，查高染种子颗完有无揭色外死病班，6.2.2病菌检验
6.2.2.1直接锁检
书候子取小片病叶效在取片二，加一薄无菌水，用扇头牙签剥离叶肉，放在低显微镜下，视察计沟中的卵拖子，妇镜检发现卵范子，以按第.4.条进PCR检测6.2.2.2组织逻明法检验别孢子
选取告额壳病产种子或病叶胃于烧杆中，刘人6%氧氧化利0.心155芯嵌蓝，常温下放罩24h后.用给布过纯消水冲浩后，去种子断乳，虑下物道盘光菌水将皇孕的赖壳、种皮、病叶罩于层微道下规观察其中控子，如筑龄发我卵孢了，可按第6.4.2条进行PC检测：E.3和苗检验
检查种菊叶片有无尖绿有无视包坏死条斑等，如有揭色坏死条斑，用第6.2.2点片法镜俊妈色环死班有无端断外孢丁。对失绿川片，需作保湿艳声将编叶展平，敏人颌制的铺有三居湿滤派的培养血户益后整于2\C，1Uo%RH条件下无光照诱发培养，5上后每隔30min观索一次，连绒观案5h说察分生跑于及具跑于还形成，形态，观察分生犯了发过程，变察时，用谢于从叶并面取小片肉眼可见的二冬再层叶片，放在载戒片上，加一滴恭要蓝染色液，克即用无菌水冲迷，再用逐水纸吸十多余的效色液，批上益班片在品微镜下规察。3
SN/T1155—2002
6.4PCK检期
6.41病叶,种子及其疑亮中提取D44取0.75g新前病叶、0.2多十病叶1.0表而带菌种-或帮瓶壳病种下从中提取DNA多见附求>,并将 1NA 背于一20保存条用。E.4.2PCR扩增
6.42.1引物及待扩增DNA
增引物税，其中 Gen:s-1 与GemLs-2是玉米粘病前DNA的特导性物,Sorghi-1与Snghi-2是高双审谢病菌DNA的待异性引物,IT5-=与1T-2是ITS区域通用引物<时)。PCR扩增的DNA样包活待检测[A,阳性对用高买箱每将闲[NA和性对肌terarru3DNA6. 4. 2. 2扩增
利用上述种约，将待扩增NA样分别进行P'R增。扩培时设追约水空白对照和来用通用引物核ITS-1与ET-2项欧最阴性现系，并按录件T变生：mia-→50r退火2min→?2C延仰3min.循环些理30次，最后在2心下延了mic.完PCR扩增参见附录B),但用引物IT11TS增时.退火度改为37心，其他条件不变，扩增后产物干一23保有条用。6.4.3琼脂糖凝胶电
将再个PCR扩书产物和b标准DA样分加人电冰能胶样品孔：进行电像跑政，电涂结束后将凝驳胃了紫外灯下观账和照格参见录。E.5监定特征
E.5.1无性阶段
去米垢病齿菌终法无弱膜，多细晒核：分生地子梗在夜间生成，无色卢立：作二效分支，分权2次5次：小极虱锥形或错形，通常？个，无性阶段直按产生分生孢子：分生孢子分为二类（参见附录T)，和的生了较小，球形或即形至球形，而和P的分生孢于较长成商形至概形免表1；分生孢子设大囊盖包大状结将-直接发成养些：表1Peranascferospora spp分生孢子，孢子梗.界跑子影态Prntefet tpur: 22
P. seerheri
P Paesippinsis
6.5.2有性阶段
分坐子按
长 13G μm~ 1x3 ±m
长15017
长15 pa--100 b:
K 15G μn -532 μm
分生型子
球形或卵圆形至球影，人心为（15.n，，球多或近球形，无巨，大2h.9 μm) (*5. 0 μm~ X3. μm)小5m42.9m
面阿形至国形，人为(15.C而-球形取近球形，丧色,大23. G μn)×(2E. xm--41. m)回两形至摘面形，人为（17.Carn21 c×2r. m~ 3.0
球形成别面形互球形-大心为！19.9T128.6 μm)×t1s. 5 ,un--29.7 un3小为43.9 em--50. 0 1:m
竿见,大小为 E5. 1
非他子单生，球形或近球形，卵跑十墅邵分率儿乎完全与检卵器整品合，能半命有不规则的竭色原（整附录，P在高梁相种领壳中产大量饱子在叶生大证卵孢子,P,:l:pprnersis即延子学见(洗表1.但Perorocteruspura sp在文上不形成即弛子。
E.53PCR特异性反应
米病诵DNA可利用等性引物Genu-1与Geaus-2经PCR特增，变长度步Cp的DNA马段，删PCR特异扑反应阳性：待检JA不能列用特早性明物Ge:us1马Gerug2进行PCR4
SN/T 1155—2002
扩增.则PCR特片性反应呈阴性、作为原性对照的高梁继穿病菌DNA，可利需特异性引物Sarghi-1与orghi2及enu：与Genug2经PCR扩地，分别扩增为lkbDNA片段和20CbpDNA片段，担作附性对照的Pentiiams[.DA不能利用特异性引物Surgli-1与Snrgi-2及Garus-1与Genus-2进行FC:R扩增：所有DNA均可利用通用引物1TS-1与IT5-2逆行PCR扩泡-并扩增为人小约300bp的DNA片段.
7韩果择定
7.1菌产生尤性阶段，且持合6.5.1条鉴定特征的，判定为玉米每病7.2末发现病断无性阶段.但发现有性阶般邮孢子，且PCR物异性反应呈片，别定为玉米霜暴病萄，8样品保
保存推品丝登记和经手人签字后于干燥，防虫酵鼠处安典保存两个月，如发现玉求粘年病菌·读样品至少需保存六个月，以备登验、读判和件按。保存期满后+需经灭薛处理，5N/1:1156—2002
附录A
(资料性附累)
玉米书霉病面哥主范国
A1高风靠零病菌（P.soryhi)套主范围玉量季属2easpp.），梁网Surghu*Pp.须芒草（Androogonspp.）.致花单宽Dichamhium app-）、假网秉属（FurklaeraFpP.）、黄茅属（Heleropogun 5pp.）.聚（Panfeumr spp.）.狼居草产(Peniaunspp.）,草(Thenedasap.)A2甘熏霜寻病菌(P.scctar)奇主范围玉蜀氧属（ZeaAp.）高果展（Sorghumspp.）.节草tAxdrupagonp.）、孔题草属（Burerigehluaspp.）种属（techinachieaspp.）螺烨草网（Etevsimsn、假写率属（Eachturnaspp，金茅压（Ealelia epp.）、芒(Maseuthus su）,季底（Panirum pp.）,头草疯R1离丝体中提取TN.
B. 1. 1 试剂bzxZ.net
B.1.1.1提取缓冲液
附录日
【资料性附录】
DNA握取,扩增与电泳
SN/T 1155—2D02
50mml/L二（羟用基）数共币（Tris）pH.2）5\mmo)/t乙二喷四艺塑（FA）.3%+二基硫酸纳(5DS)、12-统基乙酶，B 1. 1. 2TE: 缓沪液(pH8. 0)
[O mnl/I. Tris,I rimo]/L EDTA.B.1.1.3其他试剂
三氯中烷：苯（1：1）、二氧单烷：成款（24：1）.3mol/L.乙酸钠（H2.0）、片内限，乙醉，R.1.2报纯步骤
B.1.2.1收备压断丝体于航态减中而磨至势未状，需下1.5m1.Fppenrr离心管，加提取较冲液750 L,65汇 水 1 h 牢温 下于微量离心机 12 0C2 g 离心10 in,将上液移人另一离心(1. 5 rmT.)。
B.1.2.2加人700μ，元氧甲魔：年（1：1)，轻轻混勺，重温下置于微量心机1293g离心10min物上游波移人高心竺（1.ml
B.1.2.3加人7001.三氯甲烷：异成醇（241)，轻签混勺，家温下宜于该量离心机12CC5g需心5min.将上满浓够人另一高心管(1.5mL)。1.2.4加201.%al/钠加满异丙要，反例儿次空湿干量离心12C03心3i×,充上消液,并置离心管」ruin。B..2.5人3CCTE.65水带10mir.-5mic混与成污液。B1.2.6加人1CμL3mgl/L乙酸钠，加满乙醇，反豆胃几次：室温下胃于微量离心机12000g高心3，弃上滑液，雨70光艺醇冲选，关例置离心普11mi-1。B.1.2.7家温下，将离心管置于轴真空十换游中0mic.。B1.2.8加人ICLTE总浮DNA，置于-20C下保务用，B 2病叶中根取 DNA
B.2.1试剂配制
R.2.1.提取缓冲派
100mrol/Tris（pHs.0).50amol/LEDTA,552mmcl/L化药、1cmn.ol/l.2-氛基Z醇。B 2. 1. 2TE经冲液(pH8. 0>
1a mnoi,T. Tris,I numo./. EDTA.B.2.1.3其地试制
20%SDS.5mo./L乙酸钾、异丙醇、4mol/L乙前钢、二氧提：苹（1：1）、乙: mR/m. RNu+ A.
B.2.2提纯步暴
B. 2. 2. 1取前叶于减态效p研库至龄状,移人 2C mL SN/T1155—2002
B.2.2.3室温下置于微单离心机150心g离心列min。B.2.2.用三层无密约布认至另一含有ICml.习丙群的商心营（mL),轻轻泥匀，置了-20℃ 20 min,
B. 2. 2 5案退下置于崇或离心机15 U g离心1 in，A.2.2.6弃上清液，牛阅置离心管于灭菌驱水组上[0minB.2.2.7人0.5 ml. TE,轻轻据:将上消筑移入率心管(1. 5 m:),切人1μL10 mg/mLRNusrA.于7孵育1h，
B.2.2.8加人0.5mL=氧中烷：萃（1：二）经轻句至盟下监于微域离机12C5g高心5min持上清获移人另离心肾（1.5mI:
R.22.9如人50.3m/[.艺酸钠和9301.95静，轻轻据室温下置丁做量离心机120高心326弃上流液%乙冲先，关倒离心格minB.2.2.0究温下等离心管置于别款究于操器中10in，R.2.2.11加人100=1.1F尽浮DNA，置于20下保存备用，B.3PCR扩增
B.3.110×PCR绥冲液
o mnolt.氯化钾,1cc mrol/l.sis (pHs.n).B. 3. 2扩增步弹
E.3.2.1以下多组分加人次菌的Eppendort售（u.5n:1.内限合均约。组分
1CCR冲液
lumxl/L的四种dNTP混合物
5ni.nl/.戴化
引一对升物饿合，每独引物20m0:）模板DNA
DN垂台酶( /L
加灭水至放终体积
B.3.2.2人50L书教满以房水分蒸岁。B. 3. 2. 3 PCR 议,S4 C保持 3 min.容
? μL(s ng/pl.
其终浓度
u.2Tnmul/J.(穿种）
1. : mmnt/L
0,5jn1,每种
2.5单位
度变mim(或3?退水2min延仰mim臣查复处理次E.3.2.4
B.3.2.5最后在72下延悼7.in。
B.4琼服需医胶电
B. 4. 1 试剂
B.4.1110×TBH:电录暖冲夜pH8.01(含：T:i.乙酸.1、NDTA2.。
B.4. 1.25×SGB上样暖冲液
10mJ. mo/.T(s.),ml.5 mol/1.ETAp8.G).2Cx SDS1m说的述BPB>、15二甲萃车胺（X)。B.4. 1. 3其他试剂
澳化之链
E42电漆
.4.2.1将0.7%琼脂到娠有的c.5×1B线版的三瓶，加热实源脂磨济解印司。8
SN/ 1155-2002
丑.4.2,2净却率60亡对,人说化7.淀至最终浓度为0.5g/mL，注悉须藏手套择作B.4.2.3将驱脂快倒人制胶模具，凝胶再是解为L.3m-心.5cm.退变在模丹一端插上抗子，净息梳齿与校具底面之间距离不能太近。B.4.2.4待凝胶完全周后。小.心移去硫了.将据胶效人电殊概中。B4.2.5入1×1BE落冲落至电冰带中.让液面高十股面0.5cm。B4.26连INA样品宁加人五分之-的SG，准多后，师做景高心粗200离心39.B.4.2.7用移绒管DN.4样品人样品B, 4.2.3 接通电录情与泳必也微,企tcc mA 电流下心脉 5 min-1D min-踏后在15 mA--20 mA 下电漆直到拆示制(色)判讼额收的四分之三处，切新电源.R.4. 2.9取出凝胶,在载外灯下现案结未或拍照记录。雕聚C
（规范性甜录）
'CR扩增引构
洋中于扩增的引购表C.表所示，表C.1特舞性引物(姚成林1991)
Sagiu-
Suigai-2
GeEi Je-1
Grriu-2
序列5-3
GAA TCA TIT TTT AIG ATAAAT TAS TAA:TAACA TTG :TI ATG TAACT: TAA ITI ATGGIGGGA iGT (IF CGA T'A TCG AIT IGA AATC CAG GAG ACT T:I CUA ACT TAA T表C.2ITS区城PCR扩净通用引物（White心l.1990）序列5+3'
TLX: GTA GCTT GAA CCT GCG G
CCT CCCTFCTTCATCGAT CC
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