【商检行业标准(SN)】 玉米中转基因成分定性PCR检测方法

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T1196-—2003
玉米中转基因成分定性PCR
检测方法
Protocol of the polymerase chain reaction for detectinggenetically modified components in maize广州市标与
缩码信息所
2003-03-17 发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2003-09-01实施
本标准的附录 A 为资料性附录
本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标起草单位：中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局。本标准主要起草人，尊际娟、陈明生、卢行安、赵昕、王秀芬。本标准系苷次发布的检验检按行业标准。SN/T1196—2003
1范面
宝米中转基囤成分定性PCR
检测方法
本标准规足了玉米中转基因减分检验的抑样、制样,PCR检测方法。本标准的筛选检测适用于玉米中转基因成分的定性检谢,SN/T 1196—2003
本标准的奖定检适用于玉来MON810、J3t11.Fven[176,T14/T25,CBH351、GA21品系转基因成分的定性检测。
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注明日期的引用文件，其随后所有的改单（不包括勘误的内容）或够订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本，凡是不壮日期的引用文件，其摄新版本适用于本标准，GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法SN/T 1193基因检验实验室技术要求SN/T1194植物政其产品转基因成分检测抽样和制样方法SN/T1204植物及其加工产品中转基因成分实时荧光FCR定性检险方法3 术语,定义和略语
下列术语、定义和缩略语适用干本标准。3. 1
转基因tranggene
将物种本身不具有的、来源于其他物种的均能 DNA序列,通过各种导人手段,使其在该物种中进行表达，以便该物种获得新的品种特征。3.2
聚合毒链式反应polymerage chain reacilan,简称 PCk模板基因序列先经高温变性成为单链，在DNA桑个麟作用和适宜的反成条件下,据模板序列设计的两条引物分别与模板 DNA两条链上相应的一段互补序列发生退火而相互结育,接着在 DNA 疑合酵的作用下以四种脱氧糖核酸(dNTI)为底物,使引物得以延伸，然后不断重复变性、邀火和延仲这一循环，使欲扩增的基因片股以几何倍数扩增，3. 3辅略语
. 3 1 PCRtpolymeruse chain reaction,简称 PCR,3 3. 2NA,deoxyrilnnucleie μcid,脱氧核糖核酸。3 3 3 dNTP,deoxyribonucleogide triphosphnte,脱氧羧 f三磷酸,3 3. 4dATP,deuxyadeNO)Sine triphoaplhalr,脱氧腺书三磷龄.3. 3. 5dCTP,deoxycytidine triphosphate,脱氧施书三磷酸,dGTP,deoxygueNOSinc triphosplate,脱氧鸟三磷酸33.6
3 3,7dTP,deoxythymudine triphosphnte,脱氧胸书三磷酸。3 3. 8dUTP,deoxyuridine triphosphate,脱氧尿苷三磷酸。SN/T 1198—2003
3. 3. 9bp,bare peir,碱基对.
EDTA etbylenediaminetetraacetie acid.乙二胺四Z醛3. 3. 11
TagiThermusaquaticu+水生热烟菌3. 3. 12 Tris:tria(hydroxymethyl)aminomethane,三(羟甲基)氨基甲烷,TE,Tris-CI,EDTA规冲液,
3. 3. 141VR,invertaee 1 gene from tmaize,玉水的转化酶 1 基因.3.3.15Zeini玉米酵游蛋白基因.3. 3. 16
动子，
CMY35S,35SpromoterframcauliflowermosBicvirus，来自于花樽菜花叶焖毒的35S启NPTII,neomycin-3'-phosphotransferase gene,新霉素-3'-酶酸转移酶基因。NOS，terminatorof nopalineaynthagegene，期脂碱合成基因终止子。IVsz,intron from the meize alcohol dehydrogenese gene,玉米醇脱氢酶基因的基因内区 23.3 20
PAT：phosphinothricin acetyltransieraBe gene,草丁膦乙酰转降基因。3.3.21HSP70,0.8Kbintranfromthehsp70gene(heat-abockpratein），来自热休克蛋白(hs/0)基因的0.8Kb基因内区。
3. 3. 22 CrylA(b)1 a ynthetic gene encodes the first B4a amino acidstinsecticidal-active furuncatedproductidentical tothatofCryiA(b）geneof Bacillusthuringiensissubsp苏云芽孢杆菌杀虫毒蛋白 cry[A()基因。
3.3.23CDPK,calcium-dependent prateinkinase(CDPK）gene，钙依趣蛋白基因3. 3,24 CryC, insecticidal-sclive ftruncated produet identical ta thet of CrygC Rene of BacittuthuringiensisBubsp，苏云金穿孢杆系虫泰蛋白CrygC茶因。3.3.25CeMV35S!.35StermiratorofCaMVgenomc，花椰菜花叶菊毒基因组的35S练止子，3. 3. 26 P actin l,the promater derived from the rice (Oryra sativa) actin 1 gene.来源于玉肌动蛋白1基因的启动于.
3.3.27OTP：opimizedtransitpeptidekene优化谱输肽基因。3. 3 2BmEPSPS,maize 5-enolypyruvylshikimete-3-phoaphate Bynthage,来源于玉米的葬草胶羟基乙酰转移酶。
4的行缺推施
捡测过程中防止交更污染的措施按照 SN/T 1193 中的规定执行。5抽样和制裤
5. 1 拍样
按 SN/T 1194中规定的方法执行。5. 2制样
称取20g玉米样品，经干热灭两（150℃干热预处理2h）玻120℃、30min高压消毒处瑾的疆体或粉碎机中摄摩至样品粉末颗粒钓0.5mm左右大小。6 测定方法
6.1原理
样品经过提取 DNA 后,针对转基因植物所摘入的外摄基因的基因序列设计引物,道过 PCR技术，特异性扩增外源基因的DNA片断.报据PCR扩增绪果，判断该样品中是否含有转基固成分。6.2试剂和树料
除另有规定外，其他试剂为分析纯或生化试剂，水为按服GB/T6682规定的一级水，2
6.2. 1可物检测转基因玉米内、外潮基因的非物及其信息见表1。检谢转基因五米内,外通基因所碍的引糖信想表
被检测基因
（上游/下游）
CaMV a5s
CaMV 35S
IVS2/PATbZxz.net
[Malte genome
/CaMV35s
HSP70/
CryIA(h)
CryIA(b)
C-MV35S!
CaMV35S
CeMV35S/
Ctry9c
Cry9C/
CaMV35S
Paclin i/
mEPSPS
mEPSPS
基因来源
驻物序列
5'-ccgetgtatcacneggguiggtacc-3'S'-agagcecrtgtagegcntaacgate-35'-traaceatgcatgcagi-3\
5'-ggceagaccaltggtga-3\
$'-getrctacazatgccatca-3\
5'-gelngtgggettgtgcglca-3'
5'-tcatccttecgtcagtggag-3\
5'-ccatcattgcgataeeggaaa-3
5t-gatcetgttgccgRtcttg-3'
5'-ttatceiag111gcgcgcta-3\
5'--icgllcasacainggca-1
5'-ltgcegnctclateata-3
5'-nggatetcglcgigaccrut-3\
5'-gccgagxasreggicn-3
5'-gtcHACa1gIctecERERER-3\
5'-gcaeccaacteagggtatc-3
5'-acaagcacggtcaecttcc-3\
5'-ctcggccgtceagtegte-3'
5'-cigghaggccaagrtntctant-3
5'-acrgctgtugctggceluatrt-3\5'-tcgaeggncgeaaguctctacg-1
s'-lcentri ttgkgaccac iglcg-35'-ngti1eetttgttgetetee1 a
5'-zatgttggitgltgicat-3'
5'-ctctcgccatcatgttcgt 3
5'-ggtcaggc1euggrtgatgt-3'
5'-atugtggatggcalg8tgttg-3\5'-hegcgaaceetuleagueccc3
5'-ccttcgcaagaccrtcctctaln-3\5'-agatcstcaalcencteltgtestg-3's'-ccttegcaagaccetlccleinta-35'-g1sgctgicggtgtagtcctcgt-35'-tgclacaicgaccgeatcga-3
5'-cctaattccrilxiciggg 3\
5'-tctcgalcitinacettagta-
5'-tgcegcccagutatcgteta-3
5'-acggigBaagagttcaatgtntg-3\5'-tcaccugateRgcigca-3
扩增长度/圾火祖度/
SN/T 1196--2003
内源参限
托选其一
筛选检酬
筛选检测
筛选检测
筛选检测
筛选检测
整定检测
整定检测
MCIN810
监定检测
MON810
整定检测
鉴定检测
TI4/T25
定检测
T14/F25
监定检测
CBH-351
监定检测
CRH-351
鉴定险测
鉴定检测
征选其一
任选其一
SN/T 1196--2003
Ta DNA素合醇
6.2.3dNTP,dATP,dTT.dCTP,dCTP.UTP.6.2.4球脂精：电冰纯
6.2.5澳化乙链《E8)或其他染色剂，6.2.6三甲烷，
6. 2. 7异浅酶醇。
6. 2. 8 异丙醇,
70%乙醇。
分子量 Marker,50 bp~300 bp.
CTAB裂解疫，3%CTAB（质量推度），1.4mol/L氟化纳，0.2%（体积分数）殖基乙醇，20 mmol/L EDTA,100 mmol/I, Tris-HCt.pH8.0.6.2. 12TE缓*链,1a mmol/L Tris-HCl.pHB, 0,1 mmol/L EDTA+pH8. 0.6 2.1310×PCR短冲液,100 mmol/L氧化钾,160 mmol/L硫酸铵,20 mmol/1.碱酸燃,200 mmal/lTris-HCi(pH8. 8),1% Tritan X-100,1 mg/mL BSA.B.2145×TBE缓中滴：Tris548+胶2750.5mol/LEDTA(pH8.0)20mL,加热增水至1000mL
6.2.1510×上样缓种减，0.25%激盼蓝，40%期糖6. 2. 1BRNA 降(10 ug/ml.),
6. 3仅最
固体粉碎机及研体，
6. 3. 2商速降冻高心机,台式小型心机,Mini 个人高心机。6.3.3水浴培养,钜温培养箱，恒温孵育箱，6.3.4天平，感量0.001B.
63.5高压灭菌锅.
6. 3. 6高温干燥箱.
6.3.7纯水耀，双蒸水器，
冷潮、冷冻冰箱。
制球机。
施涡熏粥器，
激波炉，
基因扩增仪
电源仪.
PCR 超净工作台:
核酸蛋白分析。
微量移体解,0. 1 μL~2 μL,0, 5 μL~10 μL,2 μ1~20 μL,10 μL100 μ,20 μL~200 pL,200 μL--1 000 μL.
疑胶成像系统。
实时荧光PCR仪，
Eppendorf 管,1. 5 ml,~~5 mL
6. 3. 191
6.3.20PCR反应管，200μL,500μl.两种规格。5. 4 检谢步事
6. 4. 1摄板 DNA 提取
称取2g粉样于10mL奥心管中，加人5ml.CTAH裂解液（含适量RNA酵），滟匀，60C水浴摄类4
SN/T: 1196—2003
保温 1 bi2 000 r /tnin 高心 5 min,取 上清液,如等体积三氧甲烷/异戊醇(体租分数:24 1)混勾,静量5min,8000 t/min离心Gtmin小心取离心上清液，再加等体积三氧甲烧/异皮醇<体积分数,241)混匀,静置 5 min,8 000 z/min离心5 min取离心上清液加 0. 65 筛体积的异丙醇,混勾,12 000 r/min 4℃高离心10 minl奔上清液,加500 μL 70%冰乙醇洗涨-次,12 000 z/min 4C离心 5 min;弃上清液,将沉淀干，加人50μ[.TE，溶解沉淀（4℃过伐，或37T保温【h)此即为总DNA提取液。也可用相应市普 DNA提取试剂盒提收 DNA。6. 4. 2 PCR 扩增
6 4. 2. 1 PCR 反应体系
检测转基因玉米中内、外源基因的PCR反应体系见表2。每个反应体系应设罩两个平行反应，以转基因玉米或已知相应阳性质粒作为阳性对期，非转基因玉米作为阴性对照,以水代替模板DNA作为空白对照。
表 2 转基固玉米内、外基因检测的 PCR 反皮体系试剂名称
10XPCR+液
氧化糖(MgCl,)
dNTP(含 dUTP)
ING酶
模板DNA
双燕水
贮备液浓度
25 mmol/L
2. 5 mnol/1.
20 pnal/μt.
0. 3 μR/pl,-6 μg/μl.
25 pμl. 反成体系
加样体积/[
补至25 [
注1,反虑体系中各试剂的量可根据其体情况或不同的反应总体积避行适当测整。6. 4. 2 2PCR反虚慎环参数
50μ.反腔体系
加样伴租/μL
94℃预变性 2 min。94℃变性 40 5,55℃~58t返火 60其体退火温度详见表 13.72℃延伸 60 sr35 个循环, 72 延伸 5 min。 4 亡保存。 也可根据不间的基因扩增仪对 PCR 反应循环参数做适当潮整，
64.3PCR扩增产物电球检测
用电冰绩冲液（1×THE或TAE>制备2%琼脚瓣避胶（其中在55C～60C左右加人FH或其他染色剂至终浓度为0.5g/mL，也可在电泳后进行染色）将10μL～15μ,PCR扩增严物分别和2叫L上样缓冲液混合,进行点样。用 100 bp Laducr [D)NA Marker 或相放合适的 1>NA Marker 作分子量标记.3V/cm~5V/cm恒压，电泳20min~40mIn。凝胶成像仪观察井分析记录。6 5 堵果刻断
6 5. 1内项基因的检测
用针对玉米内源的IVR基因（或Zein基因）设i计的引物对不米DNA提取液进行PCR测试，阴性对照、阳性对照和待谢样品均应扩增出226bp(或173ip)的PCR产物。如未见有该PCR产物扩增，剧说明DNA提取质量有问题，或DNA提取液中有抑制PR反应的因子存(I，应重新取DNA，直到扩增出该PCR产物。
6. 5. 2 外源基因的检谢
对压米样品DNA提取液进行外谢基因的[CR测试，如果研比对照和空白对服米山现扩增条带，5
SN/T1196—2003
阳性对照和持测样品均出现项期大小的扩增条帮（扩增片段大小见表1），则可初步判定待测样品巾含有可症的该外源基因，应进一步进行确证试验,侬据确征试验的缩果最缺报告如果待测样品中未出现PCR扩增产物则可断定特谢样品中不含有孩外潮基组。6. 5. 3筛选检测和整定检副的择对玉米样品中转基因成分的检谢,可参见附录 A 的内穿,先谢选检测 CeMV 35S,NOS,NPTEI,PAT,RAR等因,端选检测结果阴性则直接报告结果，著筛选检测结巢阳性，则需选一步整定检[VS2/PAT,MaizeRenome/CaMV35S,HSP70/CryIA(b),CDPK/CrylA(b),CaMV35S/PAT,PAT/CeMV35S1,CeMV35S/Cry9C,Cry9C/CaMV35SI, PBctin1/mEPSrS、UTP/mEPSPS基因，以响定甚何种转基因玉米晶系，6. 6确证试验
确证试验方法按服SN/T1204中规定的疗法执行，7踏票囊迹
7. 1 未检出××××基因。
7.2检出××××基因,(可进一步推告)该捡测样品是×XX×转基因五米品系。SN/T 1196---2003
iSSEAW
ISASON
igr*(aa
ig(aae
SaS (9*2AX08
936tde
(sou ba)inbian'sseA
SSEAWE
1Pe*SSEaN
OOTOBNON
08989929
SN/T1196—2003
Sesaaa
TOLISH
[5E-1189
08982999
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