【商检行业标准(SN)】 蜂蜜中转基因成分检测方法 普通PCR方法和实时荧光PCR方法

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T2135—2008
蜂蜜中转基因成分检测方法
普通PCR方法和实时荧光PCR方法Detection of genetically modified components in honey-Contentional PCR and real-time fluorescence PCR2008-09-04发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2009-03-16实施
本标准的附录A和附录B均为规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国北京出入境检验检疫局起草本标准主要起草人：饶红、冯骞、陈广全、付浦博、曾静、汪琦、张惠媛。本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。SN/T2135—2008
1范围
蜂蜜中转基因成分检测方法
普通PCR方法和实时荧光PCR方法本标准规定了蜂蜜中转基因成分的定性检测方法。SN/T2135—2008
本标准中适用于以转基因棉花、转基因油菜等作为蜜源植物采集的蜂蜜或受到转基因作物污染的蜂蜜中的转基因成分的检测
2规范化引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682-2008，ISO3696：1987，MOD）SN/T1193基因分析检测实验室技术要求SN/T1194植物及其产品转基因成分检测抽样和制样方法3术语、定义和缩略语
3.1术语和定义
下列术语和定义适用于本标准。3.1.1
聚合酶链式反应polymerasechainreaction，PCR体外酶催合成特异DNA片段的方法，模板基因序列先经高温变性成为单链，在DNA聚合酶作用和适宜的反应条件下，根据模板序列设计的两条引物分别与模板DNA两条链上相应的一段互补序列发生退火而相互结合，接着在DNA聚合酶的作用下以四种脱氧核糖（dNTP)为底物，使引物得以延伸，然后不断重复变性、退火和延伸这一循环，使欲扩增的基因片段以儿何倍数扩增3.1.2
实时荧光PCRreal-timefluorescencePCR在PCR反应体系中加人荧光基团，利用荧光信号积累实时检测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定性或定量分析的方法。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核昔酸，两端分别标记一个报告荧光集团和一个淬灭荧光集团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被率灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5-3外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光集团和率灭荧光基团分离，从而荧光检测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有二个荧光分子形成，实现了荧光信号的积累与PCR产物形成完全同步。就是通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量PCR反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一次荧光强度信号，这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。3.1.3
定性检测qualitativedetection对样品中转基因成分进行检测，以判定该样品是否为转基因产品。1
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3.2缩略语
3.2.1下列缩略语适用于本标准。GMOgeneticallymodified organism转基因生物。
3.2.2CaMV35S35SpromoterfromCauliflower.mosaicvirus花椰菜花叶病毒35S启动子。
3.2.3NOSterminator of nopaline synthasegenefrom Agrobacteriumtumefaciens来源于农杆菌的胭脂碱合成酶基因终止子。3.2.4CP4EPSPS5-enolpyruvylshikimate-3-phosphatesynthasegene5-莽草酸-3-磷酸合成酶基因。
3.2.5IVR Invertase1gene from maize玉米转化酶1基因。
3.2.6NptlIneomycin-3'-phosphotransferasegene新霉素-3°-磷酸转移酶基因。
3.2.7CrylA(b):a synthetic gene encoded the first 648 amino acids,insecticidal-active truncatedproduct identical to that of crylA(b) gene of Bacillus thuringiensis subsp. Kurstaki steain HD-1苏云金芽孢杆菌结晶蛋白CryIA（b)型毒素抗虫基因。3.2.8PATphosphinothricin acetyltransferase gene草丁膦乙酰转移酶基因。
3.2.9BARNASEribonuclease gene from Bacillus amyloliquefaciens来源于杆菌Bacillusamyloliquefaciens的ribonuclease基因。3.2.10BARSTARspecific inhibitor of thebarnase gene from Bacillus amyloliquefaciens来源于杆菌Bacillusamyloliquefaciens的barnase基因的特异抑制基因。3.2.11 PEPphosphoenilpyruvate-carboxylase磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因。3.2.12FMV35s35Spromoterfrom a modified figwortmosaic virus(caulimovirus group)玄参花叶病毒35S启动子。
3.2.13BARphosphinothricin acetyltransforase gene抗除草剂基因（Bar）。
3.2.14CrylA(b)-CryIA(c)insecticidal-active ftruncated product identical to that of cryIA(b)-cryIA(c)gene ofBacillusthuringiensis subsp苏云金芽孢杆菌结晶蛋白(Cry)I型毒素抗虫融合基因。3.2.15GOXglyphosateoxidoreductasegene草甘麟氧化还原酶基因。
3.2.16CryIA(c)insecticidal-active firuncated product identical to that of crylA(c)gene of Bacil-lusthuringiensis subsp
苏云金芽孢杆菌结晶蛋白CryIA(c)型毒素抗虫基因4原理
蜂蜜中转基因成分检测是利用外源基因与植物本身基因的不同，通过设计只能扩增外源基因中DNA片段的引物和进行PCR扩增，根据实验结果，判定该蜂蜜是否带有植物外源基因成分，从而判断蜂蜜中是否含有转基因成分。实时荧光PCR检测是在常规PCR基础上加入荧光标记探针来实现核酸定量，由于荧光探针在PCR反应时被切割的数量与PCR原始模板量成正相关，因此，可以通过检测荧2
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光信号的强度来推算转基因含量。待测样品中转基因的含量是通过与用一系列已知不同含量的转基因标准品而作出的标准曲线拟合的数学模型计算得出。5试剂
除另有规定外.所有试剂均为分析纯和生化级试剂。实验用水均为超纯水，规格符合GB/T6682相关规定。
5.1SDS提取液：1.5%SDS.EDTA-Na2100mmol/L(pH8.0).Tris-HCl20mmol/L(pH8.0),NaCl500mmol/L
5.2CTAB提取液：2%CTAB,EDTA-Naz20mmol/L（pH8.0),Tris-HCl100mmol/L,NaCI140mmol/L
5.3CTAB沉淀液：0.5%CTAB,NaCI40mmol/L。5.4Tris饱和酚。
三氯甲烷。
5.6异戊醇。
异丙醇。
70%乙醇。
氯化钠溶液：氯化钠1.2mol/L。5.10
RNA酶(10mg/mL)。
琼脂糖。
三羟甲基氨基甲烷(Tris)。
PCR缓冲液。
dNTP。
TaqDNA聚合酶。
溴化乙锭（10mg/mL）。
100bp ladder DNA Marker。
电泳缓冲液。
电泳上样缓冲液。
2-ME（β-巯基乙醇）。
实验用水：应符合GB/T6682中一级水的规格。仪器设备
恒温水浴（10℃～95℃）。
电子天平（最小精度值0.01g）。普通离心机（Eppendorfcentrifuge5415D或其他等效设备）。6.3
低温高速离心机（MeckmanmodelJ2-21或其他等效设备）。6.5制冰机。
6.6冰箱。
恒温磁力搅拌器。
pH计（0~14.00pH.最小显示单位0.01pH,1mV）。6.9
移液器（0.1μ2μ,1μ~10μ20μ~100μL100μL~1000μL，1000μ~5000μL)。6.10PCR管（200μL)。
离心管（1.5mL2.0mL，50.0mL）。6.11
6.12PCR仪（PE9600或其他等效设备）。3
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6.13实时荧光PCR仪（ABI7000或其他等效设备）。6.14电泳仪(0V~300V)。
6.15凝胶成像分析系统。
6.16核酸蛋白分析仪
7抽样与制样
7.1抽样
按照SN/T1194中规定的方法执行。7.2制样
将装有蜂蜜样品的容器放置于37℃水浴中1h～2h，取样时将蜂蜜搅拌均匀，使下层沉淀物与上层的液体充分混勾后再称取样品。蜂蜜中DNA提取方法
8.1DNA提取
8.1.1改良SDS方法
a）称取蜂蜜样品10g放人有磁力搅拌子的50mL小烧杯中，加灭菌双蒸水20mL，40℃恒温振荡20min，使蜂蜜样品和水充分混合均匀，转移至50mL离心管；b）15000g离心10min，迅速倒掉上清液，保留沉淀。用2mL～4mL（根据沉淀的多少）的去离子水将离心管管壁上的沉淀冲洗下来，转人2mL离心管中，15000g离心10min。弃上清液，保留沉淀。若溶液体积达4mL，应分两次转人2mL离心管中，弃上清液，保留沉淀：加800μL预热到65℃的SDS提取缓冲液，混匀，转人1.5mL离心管中，放人65℃水浴锅中c
水浴15min；
15000g离心15min，取上清液500μL；d)
加RNase（终浓度10μg/mL），37℃水浴30mine
加入等体积Tris饱和酚，充分混匀；f
13000g离心15min，取上清液400μL，加入200μLTris饱和酚及200μL三氯甲烷-异戊醇g
（体积比，24：1）混匀；
15000g离心10min，取上清液300μL.加人等体积三氯甲烷-异戊醇（体积比.24：1）混匀；15000g离心5min，取上清液150μL，加人两倍体积异丙醇，轻轻混匀，冰浴10min；i）
13000g离心5min取沉淀，并用1mL70%乙醇清洗3次；k）
倒去乙醇，离心，用吸管尽可能吸去剩余乙醇。干燥后加人50μL去离子水溶解DNA。低温（一20℃）保存。
8.1.2CTAB法
a）称取蜂蜜样品10g放人有磁力搅拌子的50mL小烧杯中，加灭菌双蒸水20mL，40℃恒温振荡20min，使蜂蜜样品和水充分混合均匀，转移至50mL离心管；b）15000g离心10min，迅速倒掉上清液，保留沉淀。用2mL～4mL（根据沉淀的多少）的去离子水将离心管管壁上的沉淀冲洗下来，转人2mL离心管中，15000g离心10min。弃上清液，保留沉淀。若溶液体积达4mL，应分两次转入2mL离心管中，弃上清液，保留沉淀；18000g离心15min，弃上清液保留沉淀。加人CTAB提取液500μL和2μLRNA酶，同时c）
加人终浓度为2%的2-ME（巯基乙醇），混匀；转入1.5mL离心管，65℃温育30min，取出后置冰上1min~2min，加入等体积Tris-酚-三d）
氯甲烷-异戊醇（25：24：1），混匀，15000g离心10min；e）取上清液.加人等体积三氯甲烷-异戊醇（24：1），混匀，15000g离心10min；4
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取上清液，加人2体积CTAB沉淀液，室温放置60min，15000g离心10min；f）
g）弃上清液，以350μLNaCl(1.2mol/L）溶解沉淀，并加入350μL三氯甲烷-异戊醇，混匀，15000g离心10min
取上清液，加入0.6体积异丙醇，室温放置60min，混匀，14000g，离心8min；h)
13000g离心5min取沉淀，并用1mL70%乙醇清洗3次；i）
j）室温干燥15min～30min，干燥后加50μL～100uL去离子水溶解DNA；k）低温（一20℃）保存。
8.2样品中核酸的定量
蜂蜜样品中所提取的DNA只适合采用紫外分光光度法进行定量，所测得OD值为核酸总量。紫外分光光度法检测核酸浓度的最佳范围是2ug/mL～50μg/mL，OD值应该在0.05～1的区间内。将DNA溶液做适当的稀释，放人蛋白核酸定量分析仪或紫外分光光度计的比色皿中，于260nm处测定其吸收峰，10D260=50ug/mL双链DNA或38μg/mL单链DNA。PCR级DNA溶液的OD260mm/OD280mm比值为1.7~2.09定性PCR检测
9.1方法概述
定性PCR检测包括对蜂蜜中植物（蜜源植物和非蜜源植物）内源基因和外源基因的检测。通过植物内源基因的检测，CaMV35S和NOS等外源基因的检测，确定上述主要成分是否含有植物外源基因，从而判定蜂蜜是否被转基因植物污染，可能被何种转基因植物污染。每次PCR检测须设立相应的阳性对照、阴性对照和试剂空白对照。9.2PCR所用引物
PCR扩增所用的引物的序列及扩增片段长度见附录A。9.3PCR扩增反应体系
PCR扩增反应体系见表1。
表1普通PCR检测蜂蜜中内、外源基因的反应体系试剂名称
10×PCR缓冲液
Taq酶
正义引物
反义引物
DNA模板
加双蒸水至
9.4PCR扩增程序
贮备液浓度
25mmol/L
2.5mmol/L
5U/μL
10pmol/μL
25μL反应体系
加样量/uL
50μL反应体系
PCR反应参数为：95℃，5min；94℃.20s.引物的退火温度，40s.72℃，40s，40个循环；72℃，3min。引物退火温度见表1。PCR反应循环参数可根据基因扩增仪型号的不同进行适当调整9.5PCR产物凝胶电泳
用电泳缓冲液配制1.8%的琼脂糖凝胶。在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶。将5μL～10uLPCR扩增产物分别与适量加样缓冲液混合，点样。3V/cm～5V/cm恒压，电泳5
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20min～30min。凝胶成像仪下观察电泳结果，拍照并记录结果。9.6定性PCR的验证实验一一实时荧光PCR检测9.6.1扩增反应体系
扩增反应的引物见附录B.反应体系见表2。表2实时荧光PCR检测蜂蜜中植物内、外源基因的反应体系试剂名称
2XPCR缓冲液
Tag酶
正义引物
反义引物
荧光探针
DNA模板
双蒸水
9.6.2PCR扩增程序
贮备液浓度
25mmol/L
2.5mmol/L
10pmol/μL
10pmol/μL
50μL反应体系终浓度
25 μL
补水至50μL下载标准就来标准下载网
实时荧光PCR反应参数为：50℃，2min；95℃，10min；50个循环，95℃，15s，60℃，1min。反应循环参数可根据基因扩增仪型号的不同进行适当调整。10
反应体系中对照的设置
阳性对照：用含转基因成分的蜂蜜样品提取DNA作为模板10.1
10.2阴性对照：用不含转基因成分的蜂蜜样品提取的DNA作为模板。10.3空白对照：用配制反应体系的超纯水代替DNA模板，检测试剂是否受到污染。11
结果判定
11.1结果分析
11.1.1普通PCR检验
11.1.1.1如果外源筛选基因（35S、NOS等）中有一个检测结果为阳性，而阴性对照和空白对照未出现条带，内源基因和阳性对照出现预期大小的扩增条带，可初步判定该批样品可能带有转基因成分，可进-步检测外源基因以确认是何种转基因植物污染了蜂蜜样品。11.1.1.2如果用覆盖待检样品所有转基因品种的筛选基因进行检测均为阴性，阴性对照和空白对照未出现条带，内源基因和阳性对照出现预期大小的扩增条带，则可以判定该样品不含转基因成分。11.1.1.3如果不属于上述两种情况，则应采用实时荧光PCR检测方法进行验证。11.1.2实时荧光PCR定性检验
11.1.2.1待检样品外源基因检测Ct大于或等于42.内参照基因检测值小于或等于36.阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常者，则可判定为该样品中未检出该外源基因。11.1.2.2待检样品外源基因检测Ct值小于或等于38，内参照基因检测值小于36，阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常者，则可判定为该样品中检出该外源基因。11.1.2.3待检样品外源基因检测Ct值在38～42之间，应重做实时荧光PCR扩增。再次扩增的Ct值仍小于42，且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常，则可判定该样品中检出该外源基因。再次扩增的Ct值仍大于42，且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常，则可判定该样品中未检出该外源基因。11.2结果表述
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蜂蜜样品中检出或未检出CaMV35S、NOS、NPTII基因、CryIA（b）、BAR等外源基因。12
防污染措施
检测过程中防污染措施按照SN/T1193中的规定执行。SN/T2135—2008
被检测
所有植物通用
内源基因18S
rRNA(PUV)
CaMV35S
FMV35s
CP4-EPSPS
（修饰）
GOX(修饰）
BARNASE
BARSTAR
CryIA(b)
CrylIA(e)
CryIA(e)
附录A
（规范性附录）
普通PCR检测蜂蜜中植物内、外源基因的引物序列表A.1
普通PCR检测蜂蜜中植物内、外源基因的引物序列列表基因性质
所有植物内源基因
油菜内源基因
玉米内源基因
外源基因
外源基因
外源基因
外源基因
外源基因
外源基因
外源基因
外源基因
外源基因
外源基因
外源基因
外源基因
引物序列
5'-ATTCCAGCCTCCATAGCGTATA-3”5*-TTCCATGCTAATGTATTCAGAG-3′5'-GCTAGTGTAGACCAGTTCTTG-3
5-CACTCTTGTCTCTTGTCCTC-3′
5-CCGCTGTATCACAATGGCTGGTACC-35\-GGAGCCCGTGTAGAGCATGACGATC-3'5*-GCTCCTACAAATGCCATC-3\
5'-GATAGTGGGATTGTGCGTCA-3
5′-AAGACATCCACCGAAGACTTA-3\5'-AGGACAGCTCTTTTCCACGTT-3\5-TTAAGATTGAATCCTGTTGCCG-3
5*-TAATTTATCCTAGTTTGCGCGC-3\5′-CTCACCTTGCTCCTGCCGAGA-3'5*-CGCCTTGAGCCTGGCGAACAG3\
5′-GTCGACATGTCTCCCGGAGAG-3'5'-GCAACCAACCAAGGGTATC-3\
5'-ACAAGCACGGTCAACTTCC-3
5°-ACTCGGCCGTCCAGTCGTA-3\
5-GACTTGCGTGTTCGTTCTTCC-3*
5'-AACACCGTTGAGCTTGAGAC-3'
5°-CTCTTGTTTCGTCGTTTCATC-3\5’-GAAACCCATCCACTTGGAGTGA-3\5°′-CTGGGTGGCATCAAAAGGGAACC-35'-TCCGGTCTGAATTTCTGAAGCCTG-35′-TCAGAAGTATCAGCGACCTCCACC-3*5'-AAGTATGATGGTGATGTCGCAGCC-3\5′-GTTCGTTCTCGGACTAGTTG3′
5'-GGAGAGCTGGGTTAGTAGGA-3′
5-GTTCCAGCTACAGCTACCTCC-3
5'-CCACTAAAGTTTCTAACACCCAC-3*退火
温度/℃
附录B
（规范性附录）
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实时荧光PCR检测含转基因成分的蜂蜜内、外源基因的引物序列及扩增片段长度表B.1
实时荧光PCR检测含转基因成分的蜂蜜内、外源基因的引物序列及扩增片段长度列表检测基因
CaMV35S
tRNALeu
18SrRNA
PE3-PEPcaSe
棉花内源
基因片段
(acpl)
FMV35S
Cry lI A
CrylA(b)
引物序列（5°-3\）
CGACAGTGGTCCCAAAGAT
AAGACGTGGTTGGAACGTCTTC
ATCGTTCAAACATTTGGCA
ATTGCGGGACTCTAATCAIA
CGAAATCGGTAGACGCTACG
TTCCATTGAGTCTCTGCACCT
CCTGAGAAACGGCTACCAT
CGTGTCAGGATTGGGTAAT
CCAGTTCTTGGAGCCGCTTGA
AAGGGCCAGTCCAAATGCAGA
ATTGTGATGGGACTTGAGG
CTTGAACAGTTGGATGGATTGGTG
GTCGACATGTCTCCGGAGAG
GCAACCAACCAAGGGTATC
AAGACATCCACCGAAGACTTA
AGGACAGCTCTTTTCCACGTT
ACAAGCACGGTCAACTTCC
ACTCGGCCGTCCAGTCGTA
TCCGGTTACGAGGTTCTT
CCATAGATTTGAGCGTCCTTA
GTCTTCGTGTTGCTGGAACCGTT
GAACTGGCAGGAGCGAGAGCT
CGCGACTGGATCAGGTACA
TGGGGAACAGGCTCACGAT
探针序列（5'-3\）
TGGACCCCCACCCACGAGGAG
CATCGCAAGACCGGCAACAGG
GCAATCCTGAGCCAAATCC
TGCGCGCCTGCTGCCTTCC
CAGGTCGCTATGCGACTGCGG
ATTGTCCTCTTCCACCGTGATT
TGGCCGCGGTTTGTGATATCG
TGGTCCCCACAAGCCAGCTGC
CCGAGCCGCAGGAACCGCAG
ACCTATGCTCAAGCTGCCAAC
TGCTCACGTTCTCTACACTCG
CGCTCG
CCGCCGCGAGCTGACCCTGAC
基因性质
外源基因
外源基因
（内参照基因）
真核生物
（内参照基因）
（内参照基因）
(内参照基因）
外源基因
外源基因
外源基因
外源基因
外源基因
外源基因
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中华人民共和国出人境检验检疫行业标准
蜂蜜中转基因成分检测方法
普通PCR方法和实时荧光PCR方法SN/T2135—2008
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书号：155066·2-19272
定价10.00
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