【商检行业标准(SN)】 食品、化妆品和饲料中牛羊猪源性成分检测方法实时PCR法

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T2051—2008
食品、化妆品和饲料中牛羊猪源性成分检测方法室
实时PCR法
Determination of bovine,ovine,porcine-derived materials infood,cosmeticandfeedReal-timePCRmethod2008-04-29发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2008-11-01实施
SN/T 2051—2008
本准闷附录 F 为规范性附录.附录 A,附录 13.附录 (:.附录[),附录 E 为资料性附录本标准山国家认证认可监督管埋菱员会提出并归口，本标起草单位;中华人民！和国辽宁出人境检验检疫局，下牛物工理（大造)有限公』中国检验险疫科学研究院，
本殊准工要起市人：曹际妒、李品良、彩秋刀、于爱丽、陈锁、姚坝、谢璜。本标准系苦次发布的出入境检验检疫行业标准1范围
食品、化妆品和饲料中牛羊猪源性成分检测方法实时PCR法
SN/T 2051—2008
本杀期定了食品、化妆品和饲料中羊（绵羊和山羊）猎源性成分实时CR龄测方法：本标准适用十食品、化妆品和料中：，羊（绵羊和山羊）猪源性成分的鉴别检测2规范性引用文件
下列文件中的祭款通划过本标滩的引用而成为本杀谁的条款。凡是注期的用文件·其随后所有的修单（不包括勘误的内容)或修订版均不适月于本标准，然市，鼓扇根据本标准达成协设的行方在究是否可使用这些文件的最新版本。儿是不注期的引用文件，其最新版本适用于本标准，G3/T6682分新实验室用水规格利试验方法（GB/T6682—1992.nCIS03696：1987）319489实验室牛物安全讯用要求3术语和定义，缩培语
下列术谱初定义、继略证适用于本标准：3.1术语和定义
hvine-derived malerials
牛源性成分
下种属特异性NA片段
ovinc-rlerived materials
羊源性成分
羊种属特另性 INA 片段,
porcine-derived malerials
猪源性成分
猎种属特异性: TDNA 片段。
实时荧光 Pckreal-time fluorescent pcR实时荧光聚台嗨链式皮应
Ct 值 Cyele threshald Ct
盘·个反成管内的爽光信号达到设定的阙值时所经历的循怀数：3.2缩略语
INA deoxyribonuleic Hcid
脱氧该糖核酸。
PCK polymerase chain reaction聚合酶链式皮应：
$N/T2051—2008
TayThermusuguatic
水生尴热菊。
FAM 6-curboxyfluurescein
6羧基荧光素：
Rox 5-carboxy-X-rhodamine
-羧毕-X-罗丹明：
IeX 5-hexachloro-flnorescein6 羧基 2°.1.1.5°.7.7六氯葵光素3.2.7
Cox I Cylochrume C oxidase subunit I纠胞跑色索C氧化亚单位-
4原理
本标准采用anMan实时荧PCK技术根据线粒休DNA(COXT）毕因上动物种间彩态性的差异而进行动物源性种类鉴定。本标准成用彩负炎光检测技术，采用多重P尺方法，牛，羊,猪源性成分单体系检测叫对反应液中含有的两种不同炭光染料进行双道同步检测.在同反市管内对小改单或划猎的COX1基因及内参照反应同时进行扩增·并通划标心两种不同荧光物质（FAM、HEX)的特另性探饣进行特异性杂交-两色荧光向亲俭测；牛羊源性成分泥合体系检测时，烂反应液中含的三种不同荧光柒料行三通道向步检测.在向一反节内分别对牛、平特异的（XI基因及内参照（IntcrnaCo1rol)同叫进行扩曾并池过标记三神不同光物质（FAM，HEX，R(X)的特异性探针进行特异性杂交：多色炎光同步检测，其中,对内参熙反应的检测：可以监控反应是否正常过行·防止假阴结果5材料与试剂
5.1设备和材料
实时炭光PCR检测系统，
高速台式冷冻离心机（最度转速2)/min以【）台或离心(最高转速2o /in)
振荡器。
冰(2~8和2080)：
微量可移液器及配套吸头（10,10L0）实凝光PCR反成管
离心管。
水溶槽。
训热器。
可移动紫外灯，
5.1.12磁力架，
5.2试剂
除指别说明以外：所用试剂均为分断纯，水为按照（13：T6682规定的一级水：所行试剂钧用无NA酶汀染的穿器分激
5.2.1基因纠INA提戒试剂盒1::成,功能及使用法意事项参见除录A：SN/T 2051—2008
5.2.2什源性成分实寸蒸光PCR检测试剂含！：成、功能及使,刀运意事顶参见际录B5.2.3单源性成分实炭光CR检测试剂盒1:：补成功能及使用意事项参见除录（5.2.4猪源性成分实炭光PCR检测试剂盒1：成，功能及使用法意事项咨见除录5.2.5牛羊源性成分实时荧光PCR检测试剂盒～：组成、5能及使币注意事项参见附录F，6抽样
6.1采样工具
下列采样工只应经180℃十2℃2h高温火菌剪刀,镊子托子6.2样品采集
待检样品装人一次性塑料袋战其他火菌容器·纷弓，送实验室，6.3样品储运
样品采集店，将采集的样品放人密间的塑料袋内（一个采样点的样品煎入一个塑料袋），于温箱中加冰.密封：送实验室。
7操作方法
7.1实验室的设备和管理
实验室的设备与管理见附录 F。7.2样品模板1>.4的制备
7.2.1在样本制备区过：，组成、功能及使注意亦项参见附录A，7.2.2食品和饲料中基内纽INA的提取试剂盒念见附示A中的第A.1章固态品和何料中基因组 TDNA提取试剂盒处埋样旧
7.2.3液态食品机化妆品中基因纠I八A的提攻试剂盒参见附录A中的第A.2液态食品和化妆品中基因组IVA提政试剂盒处理样品。模板INA溶液煎于冰上保存备历。长期存须存数于一20T或—80T冰箱。
7.3检测
7.3.1扩增试剂准备
在反成据合物配制区进行，确保检测结果的准铺性：在进行实际样品检测时：做段杀户对照、阿性刘照利阳性对照实验。实时荧光CR反应体系见表1。从牛、单、独、一作源性成分实寸荧光PCR检测试剂盒（分别参见附录B,,,E)中夜山相版的实时爽光PR反成用试剂:融化后2000 r:rnin离心，向每个实时荧光P'R度衍分装21ul度应混合液（除模板1)NA外）.转移至上梓区。
表 1实时荧光 PCR反应体系
武浏成分
2X预温液
物泥个液
深计混合液
详品 DNA:1 =g/rl..-13: ng/ml.Ht)
注I：牢照实摘时.川dH营代样品 DNA。注：剧性对照实将时.川非标源性或分些代样品，注：阳性对照实验时.川相的牛或下或猪或牛单很合皆代样品INA体！
12. 5 μl.
1）山定单停提供，给这一息是为了方独弥谁的使，离不衰示态滋产品的认叫，如状H他等效产品H行机尚的效集，可位这些等效产品。$N/T 2051—2008
7.3.2加样
在上伴区进行，在答设定的实可光R反管中分别加人制资的模版落灌：品紧管，离心5 510 s
7.3.3实时荧光 PCR检测
在检测风进行。将本标准7. 3. 2中离心后的实时荧光PCK反市管放人实时荧光P'R龄测系统内:记录样本摆放顺序，活坏条件设置:95%/1℃ 5：1 个循坏;95℃/5 s:60℃/20 5（24 $,30 s.31 5.+s)：4个循不.在次循不的退火时收集荧光。检测结束后，恨据机增曲綫和（1.值判定结果。8结果判定
8.1结果分析条件设定
直接读攻检测结集，阅估设定原则根据仪端噪声情况逆行速整。8.2质控标准
8.？.1牛、羊、猪源性成分单体系检测阴性对照：HFX荧光信号检出·并出现典型的引增曲线，C1.值应小于 28,C.而,元 FAM荧光信号检出8.2.2牛,羊遗性成分派合体系检测阴性对赋：有HEX获光信号检出-并出现典型的增由线,C1.估应小于28.（而无FAM礼ROX荧光信马出：8.2.3牛、羊、猪源性成分单体系检测阳性对照：FAM和HEX荧光信号检出.并出现典型的引增曲线，t值应小于28.9
8.2.4牛羊源性成分合体系检测门性对照：有FAM,R0X 和HEX炎光信号检出,并出现典型的扩塔山线.℃t直应小于28.（。
8.3结果判定与表述
8.3.1有效原则
C1 估小十等十35 视为有效值,C1. 大于 35 视为效估8.3.2结果的判定
8.3.2.1当使用附录C、I)对牛羊猎源忙放分总体系龄测时，实验结呆的划定况说明见表2.表2对牛、羊、猪单体系检测时结果的判定情况FAM蒸光
HEX荧光
结淘能情
妇果同时逃的剧件对照实验结果正常，检实际栏品不管HEX索光信号足否检出（如果检测平浓度高会抑内参T)NA的了培）：如果有FAM荧光检出,几（1值小于等于35,判完为合仁牛、单、猪源些皮分：如来CI值尺于川谢为不含有,羊源性成分，
如果同叫进行的叫性刘照实羧果正常,格测实际烂品时有II荧格止：方FAM荧光检圳是为不含牛，羊猪激性成分『CR反成失败，汗意以下方面后市次进行反,就;）如果时谁订的阴性对照实验结果正常,则可能是栏品A制衍有间题郊栏品中可能孕在FCR反应的抑制泌等：6）如果司时进行阿任对照实验结果不止常，则可能呆实验操作失败或议剂大活
8.3.2.2当使用附录E对：，羊源性成分混合体系检测实验结果的判定情况说购见表3。使压A22ecIiosvetems公了Real Te[R护格仪技择假器型设家同时问，IT设定为0s：7000/730设定为31s7(0设定为3137u设定为2.\AM荧光
ROX光光
8.3.3结果的表述
表3对牛、羊混合体系同时检测时结果的判定情况HEX爽光免费标准下载网bzxz
给果判定情况
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如来同时进行的剧性对照实将结果止常：慢法实际样品，不些HEX益光信足谷格出（如果格测栏品依高会抑制内疹照NA次增)，如是有FAM长光恰后:几（ 值小十等于.判定为含方牛源性成分;如果（I值人于 ,可魂为不个有牛源性成分。RX荧光检山,判是为不年有羊炼性段分：
如果同叫进行的阴刘照实物约果正常·格汇实际样品，小件II荧光信号是检如集检测栏品派度高会抑制内参照的抗增），如具行炭光检出.几（值小于等于,判定为含亡源性成分;！（值尺十.可视为不含有激性成分，无 FAM荒光检;别是为不含有牛源性分
如果固时递行的的件对照实验结果正常，检买实际样品胎，不管HEX荧光信是否检出（如检测栏品滚度商会抑制内参照A培F4M用ROX英原时检出（t值小于等丁5，判定为即含有源性成分义含准源性或分;如IAM通道[t 们天于.可视为不含有三激性分：如！ROX通道CI值大于37，可视为不含个羊源件成分，如术同时进行的阳当对照实将结见正常，检测实际样H时方HEX长光检出：无FAM荧光碰出判定为不含有牛源性成分：R门X茂光检,判定为不含有单源任成分，
TCR反成生败汗意以下方面后次进行反,就）如果同时行的H芒对照实验结！正营,划可能是样品A行行问题,刻详可能存在[反成的低剂物等：如果可时进行的性对照实验结果示正常,则可能是实验择作失效h）
感成剂尖活。
结界除述为“检出牛，羊,猪源性成分。和\未俭出兰羊.猪源烂成分。\9测定低限
在上述条件下本法的测定低限为0.1。5
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附录A
（资料性附录）
食品，化妆品和饲料中基因组1N4提取试剂盒的组成，提取方法和注意事项A.1固态食品和饲料中基因组DNA提取试剂盒以宝生物上程（人连）取公而的通而基因组D>A提取诚剂含（货号N0.I)V811)为例：A. 1. 1试剂盒组成
本试剂盒分试剂与杜子纠合两部分，链个试剂盒可做个品的处埋:位括以下成分：a）试剂见表A.1。
试别组成
RNA分酶 A m/I
浒液A(S0-0A)
济没RSrlnvi-R:
辫波Solutan C)
缓没(DR Buff=）
清洗液
清洗液B
洗脱被
性了纠合见表A.2
试剂组或
肉心拉子
收集谷（2ml）
A.1.2说明
激呈支
A.1.2.1RNA 分解酶 A1为混浊溶液.于20℃保存:溶液（于1℃保存:H他于空温朵存，A.1.2.2实验前需准备65C水浴。4.1.2. 3溶液 A,溶液B若出现沉淀:请于 65℃加热浴群，待恢复至宰温后纯用。4.1.2.4洗脱结合于DNA制备膜上的基内INA：把洗脱液或灭菌蒸锂水咖热至 S5℃使用将会提高基因组 TNA 的洗脱效率
A.1. 3功能
本试剂盒可用」从固态食品和须料中提取率因组INAA.1.4提取步骤
A. 1. 4. 1取待检样品 109 mg 」巴灭因研体中:JI人液氮充分研磨A.1.4.2加入63L的济液A和0.9的RVA分解酶A1后，将弃置十65%水浴研磨1mmA.1.4.3妆集研册好的浆液移允收集管中：如果匀浆体积不足650.补充率液A650叫L，55C保温min
A.1.4.4剂人00 1的溶液13.振荡器上振荡混合A.1.4.5小人1nL的4℃预冷的浴液C：充分泥匀后：12cur/nn离心1mir6
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A.1.4.6弃「层有相再加1m的4℃:预冷济液C，充分混匀后，12o/1mi离心1iA.1.4.7齐去上层有机相.然店将小相溶液（儿色下层)移人于收集管上的滤杯.12 009 r:n1ir窝心 lmin,
A.1.4.8齐滤杯在滤液中加人10叫的[缓冲液-泥今均。4. 1. 4. 9将试剂盒中的离心三安置于收案上：将A 1. 4. 8混合溶液转移牟窝心机子中12 u /imir离心 1 min.充滤液
4.1.4.10将c0rL的猎流液A加人至离心烂「中：1200/min离心3.弃滤液。.1.4.11将700rL的猎流液沿离心性管壁四周加人1200/1mir离心30 s.弃滤液。4. 1.4. 12重复操作步骤A.1.4.114. 1. 4. 13将离心柱了安置于新的 1. E 1mL的离心管 上:在离心柱了膜的中央处加人 50 μL-~20 L的65℃灭菌裘馏馅或65℃洗脱液，室温韵置11minA.1.4.14120 r/mir-离心1 min.洗脱A，此即为模板[>A溶波。模板DNA溶液澈于冰上保存条而。告长期保存应存放于一2或一α冰箱。A.1.5使用时的注意事项
A. 1. 5. 1 进行样品处理时必须避免交义污染。A. 1. 5. 2依月液氮研落详品时;成随时加入液氮,以确保提取的素因组 1)NA 不被降解A.1.5.3在两相分离操件中:将水相落液（无色下层)移人环时：请务必陈尽上层半色有机相：否刘将阻码\NA结合到I》>A制备股上：椎间沉淀不必考德，在划滤时将被去除。A.1.5.4部分试剂巾含刺激性化合物·操作时请半上乳校于套和眼镜·避免沾染皮脱和限哨等：并尽量在延风中进。节沾染皮肤,眼晴时,要部叫用大量清水冲洗，必要可应寻求医疗咨沟4.1. 5. 5基因外.IVA需长期保存叫，建议在洗税液中保存，A.2液态食品和化妆品中基因组13NA提取试剂盒以青港基因晶片开发有限公可的液态食品INA提取试剂盒（货导E111115)为例：4.2.1试剂盒组成
试剂盒纠放见表 A. 6,
表A.3试剂盒组成
试剂组成
双解液
凉缓冲液 1
冲洗装汁波”
即要冲镀3
佳上悬浮液
洗脱动液
A.2.2说明
2x15ml
A.2.2.1开始提取前.应37预热裂辩缓冲液和冲洗缓冲液13I=1i11以使晶体游解：平将其冷划湿
. 2. 2. 2使月码十和流脱液之前,光将它们戒出并升允室温：A.2.2.3除非特别说明,所有操作均在空温进行：A. 2. 3功能
本试剂盒叫用于从化妆品中提取基因组IVAA.2.4提取步骤
A.2. 4.1收装有9.9mL裂整级冲液的离心管,1c oru r/min离心3 s7
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A.2.4.2向该裂触缓汗液的离心管中加入μ1样品·颠倒混合2次~-3次：A.2.4.3在振荡器上振荡硅十是浮液-也逆间步骤A，2.小.2中的每一个装裂解缓汁液闪节中加人5叫趾十悬浮液。娠荡-泥今均列。A.2.4.4将离心管在室源下放置1min(不需要湿合），将所有的离心管5ur/mir离心2minA.2.4.5将离心管放到磁性衣架上使硅土形成小球，小心移走上清（当吸上清可不要学走离心管,将其放在越性表架上，以防搅动小球）向每一个离心管加人40:μ1.冲洗缓冲液1。A,2.4.6从架了移走离心管,轻轻压上下颠倒离心管数欲直例小球完全重悬。A.2. 4. 7秉复以 A. 2. 4. 4到 A. 2. 4. 6 的洗涤步骤：上中.月40 μ[.冲选缓冲液1洗一次用,i0 T冲洗缓冲液2洗两次：用.u.冲缓冲液”洗一次汗：不要让样品在凉洗缓冲液子宁停望太时·变则会降低梭酸的提取A.2.4.8录后步冲洗后·用11L移液枪小心移与残留的冲洗缓冲液3A.2. 4. 9问每个离心节中加人0μ1. 洗脱缓汁液A.2.4.10从梁三工移走窝心管.轻轻地敲打闷心管直到小球完全重悬。将硅土重思的离心管在e\放昏Emin：以洗脱孩酸，4.2.4. 11
4.2.4.12将管放到磁性表架上使硅土形成小球A.2.4.13将提取的核酸上清移划一干许离心管中（确保十不被移走）。比即为虞极TDVA溶液：模板NA溶波放于冰上保在备,刀，若长期保存应存放于一2)℃或一0冰箱。A.7.5使用时的注意事项
A.2.5.1实验过程巾要带于套：
4,2. 5.2避免与皮腰或衣服直接接触A.2. 5. 3在化学通风厨渠作,避免吸人有言气体co
1.1试剂盒组成
附录B
（资料性附录）
牛源性成分实时荧光PCR检测试剂盒的组成SN/T 2051—2008
以完牛物工轻（大连)有限公而的三源性成分实时我光PR检测试剂盒（货号N.I1S)为例：盘个试剂盒可做！0个反度（21,/反成）,位括表3.的成分：表B.1
试剂组成
2牛凝性碰汇颈混液
源检测引物混合没
源检测计混合没
三源烂接测性模板（)
B.2说明
以上许组放于20保荐
B. 2. 22X牛源性检测预泥液中含行反途所需 dNTP 视合液,缓冲液、嗨等65l
B.2.3牛源性检测引物混合液中含有视增牛素因纠INA及内照的引物及内参照B.2.4牛源性检测深纠混合液中含有检测牛基内纠DVA的探针及检测内溶照的探针探混合液应避光保存
B.3功能
试剂盒可用」食品、化收品和料中与源性成分的鉴定。B.4：使用时的注意事项
B.4.1在检测过程,应严防不向样品间的交受污染。B.4.2上机前检查行反显管叶是告在气泡，反应管是告益案，以避免影响荧光信号的检出及荧光物质泄污梁仪器。
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C.1试剂盒组成
附录℃
（资料性附录）
羊源性成分实时荧光R检测试剂盒的组成以牛物工轻（大连)限公而的羊性成分实时光PCR检测试剂盒（货号N.I!)为例册个试剂盒可做！个反底（2I/反成）),位括表（「的成分：表.1
试剂组成
2羊螺性汇颈混液
羊源检测引物混合没
羊源检测保计混合没
单源烂接测性模板（)
C.2说明
以上组成于2陈存。
. 2. 1
C.2.22×平源性检测预混液中含午反应所需clNTP混今液、毅冲液、莓等，积
C.2.3羊源性检测引物混合液中含有增羊（包括绵羊和山羊)基内纠LVA及内参烂的引物皮内咨照，
下源性测探针混今波中含有检测丫（包括绵丫和山)基固维DA而探针及检测内参照探针，深针混合液应性光保存
C.3功能
试剂盒可用十食品、化妆品和饲料中羊包恬绵羊和山羊)源性成分的些定：.4使用时的注意事项
C.4.1在检测过理！.显严防不向详品间的交支污染C.4.2上机能检否各反成管中是否有气范、反成管是否益紧.以避免影响炎光信号的检出及灭光物质泄污染仪器。
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