【商检行业标准(SN)】 豇豆重花叶病毒检疫鉴定方法

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T2055—2008
豇豆重花叶病毒检疫鉴定方法
Identification of cowpea severemosaicvirus2008-04-29发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2008-11-01实施
本标准的附录A为资料性附录。
本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T2055—2008
本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国北京出人境检验检疫局本标准主要起草人：李桂芬、李明福、魏梅生、张永江、相宁、王金花本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准I
1范围
豇豆重花叶病毒检疫鉴定方法
本标准规定了豇豆重花叶病毒检疫鉴定方法本标准适用于可能带有虹豆重花叶病毒的进境种苗或繁殖材料的检疫和鉴定2原理
SN/T2055—2008
豇豆重花叶病毒学名：cowpeaseveremosaicvirus，缩写：CPSMV。豇豆重花叶病毒的生物学、血清学特性是本标准制定的主要依据；该病毒的分类地位、寄主范围、病害症状、地理分布、传播途径、粒体形态等参见附录A。
仪器和用具
3.1仪器
3.1.1酶标检测仪
3.1.2天平(0.001g)。
3.1.3水浴锅。
3.1.4隔离温室。
3.2用具
3.2.1可调移液器、可调移液器吸头3.2.2酶联板。
3.2.3Eppendorf管。
3.2.4研钵。
4检疫鉴定方法
豆类种子检测前的处理
应将种子播种在经高温消毒过的土壤中，置隔离温室中培养并观察生长情况，待长有6片～8片真叶时进行检测。首先选择可疑病毒症状植株进行检测，同时也要随机抽取植株样品进行检测4.2双抗体夹心酶联免疫吸附测定法4.2.1试材
4.2.1.1酶联板
使用质量有保障厂商生产的酶联板。4.2.1.2包被抗体
特异性好的抗豆重花叶病毒抗体4.2.1.3酶标抗体
碱性磷酸酶标记的抗虹豆重花叶病毒抗体。4.2.1.4包被缓冲液（pH9.6）
碳酸钠（NazCO3）
碳酸氢钠（NaHCOs）
叠氮化钠（NaN3）
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用蒸馏水定容至1L，4℃储存
4.2.1.5洗涤缓冲液（PBST、pH7.4）氯化钠（NaCI）
磷酸二氢钾（KH2PO）
磷酸氢二钠（Na2HPO）
氯化钾（KCI)
吐温-20（Tween-20）
叠氮化钠（NaN）
用蒸馏水定容至1L。
4.2.1.6样品抽提缓冲液
亚硫酸钠（Na2SO3）
聚乙烯基吡咯烷酮（PVP，MV24000~40000）用洗液（PBST)定溶至1L，4℃储存。4.2.1.7酶标抗体稀释缓冲液
聚乙烯基吡咯烷酮（PVP.MV24000~40000）牛血清白蛋白（BSA)
用洗液（PBST)定溶至1L、4℃储存。4.2.1.8底物缓冲液
二乙醇胺（C4HiNO2）
蒸馏水（H2O）
用盐酸（HCI)调pH值至9.8.然后用蒸馏水定容至1L,4℃储存。4.2.2实验步骤
4.2.2.1按要求的浓度和需要的体积用包被缓冲液稀释包被抗体，每孔加100μL。酶联板加盖或用保鲜膜包好，放在37℃孵育2h。4.2.2.2清空酶联板孔中溶液，用PBST加满各孔，3min后倒掉孔中洗涤液.在吸水纸上拍干。再重复2次上述洗板过程。
4.2.2.3待检样品按1：（2～10)（质量浓度）加人样品抽提缓冲液，在研钵中研磨，低速离心，吸取上清液加人到酶联板孔中（100uL/孔），每个待检样品设2个重复，设阳性对照孔、阴性对照孔、缓冲液对照孔。加盖或用保鲜膜包好，4℃冰箱孵育过夜4.2.2.4清空孔中溶液，先在自来水下彻底冲洗3次：然后用PBST加满各孔，3min后倒掉，在吸水纸上拍干。再重复2次上述用PBST的洗板过程。4.2.2.5按要求的浓度用酶标抗体稀释缓冲液稀释酶标抗体，每孔加人100μL，加盖或用保鲜膜包好，37℃孵育4h，
4.2.2.6清空孔中溶液，先在自来水下彻底冲洗3次；然后用PBST加满各孔，3min后倒掉，在吸水纸上拍干。再重复2次上述用PBST的洗板过程。4.2.2.7按1mg/mL的浓度将对硝基苯磷酸二钠盐溶于底物溶液中（使用前配制并注意避光以防变色制成底物溶液。每孔加人100L底物溶液。加盖或用保鲜膜包好，室温避光孵育至颜色合适时读数。
4.2.2.8酶标检测仪405nm波长下测定各孔的吸收值。4.2.3结果判定
4.2.3.1对照孔的OD405值（缓冲液孔、阴性对照孔及阳性对照孔)应该在质量控制范围内，即：缓冲液2
SN/T2055—2008
孔和阴性对照孔的OD405值小于0.15，当阴性对照孔的OD405值小于0.05时，按0.05计算；阳性对照OD405值/阴性对照OD405值大于5；孔的重复性一致。4.2.3.2在满足了4.2.3.1质量要求后，结果可判定如下：样品OD405值/阴性对照OD405值大于或等于2，判为阳性。必要时需要重复做一次酶联实验，以便排除假阳性反应，得到准确无误的结果。样品OD405值/阴性对照OD405值小于2判为阴性4.2.3.3若满足不了4.2.3.1的质量要求，则不能进行结果判定、4.3生物学测定
4.3.1试材
4.3.1.1鉴别寄主
苋色藜（Chenopodiumamaranticolor）、菜豆（Phaseolusvulgaris）品种Pinto、虹豆（Vignaunguiculata）品种BlackeyeEarlyRamshorn。4.3.1.2研磨缓冲液
0.01mol/L磷酸钠缓冲液（pH7.2)4.3.1.3硅藻土。
4.3.2方法
4.3.2.1研磨
样品按1：（2～10)（质量浓度）加入研磨缓冲液，在研钵中研碎。研碎后放人硅藻土（浓度为0.5%)并与病汁液混匀。
4.3.2.2接种
苋色藜接种苗龄：4片～6片真叶。菜豆（Phaseolusvulgaris）品种Pinto接种苗龄：子叶期或第一片真叶出现。虹豆（Vignaunguiculata）品种BlackeyeEarlyRamshorn接种苗龄：子叶期或第一片真叶出现。先将要接种的植株叶片用牙签等穿孔作为接种叶片的标记，然后用手将样品汁液轻轻涂抹于鉴别寄主叶片上表面。
4.3.2.3冲洗免费标准bzxz.net
用蒸馏水冲洗叶表面。
4.3.2.4标记
做好标签，置于隔离温室中。
4.3.2.5隔离温室条件控制
在自然光照下，温度控制在20℃～30℃。4.3.2.6观察
及时观察记载寄主反应。
4.3.3鉴别寄主症状
宽色藜：接种叶出现坏死斑症状，没有系统症状菜豆（品种Pinto）：接种叶出现环死斑症状，没有系统症状豆（品种BlackeyeEarlyRamshorn）：接种叶出现褪绿斑症状，并且通常有红色坏死斑，有的主要叶脉变成红色和坏死，系统症状为花叶、黄脉、畸形、坏死。5检疫鉴定结果判定
样品酶联检测结果为阳性，生物学测定鉴别寄主反应与描述相吻合，可判定待检测样品带有豆重花叶病毒。
SN/T 2055—2008
样品保存
种子类样品保存6个月，如果发现带毒样品保存1年。豆类植株中发现病毒的，采集病叶干燥后放一20℃保存。检测原始记录、照片等文档按有关规定做好登记、标记和存档.以便必要时复核A.1分类地位
附录A
（资料性附录）
豇豆重花叶病毒的背景资料
豇豆花叶病毒科（Comoviridae），豇豆花叶病毒属（Comouirus）。A.2寄主范围
A.2.1自然寄主
SN/T2055—2008
毛蔓豆（Calopogoniummucunoides），直生刀豆（Canavaliaensiformis），距瓣豆（Centrosemapubescens），麻（Crotalariajuncea），Desmodiumcanescens，大豆（Glycinemar），大翼豆（Macroptiliumlathyroides），菜豆（Phaseolusuulgaris），四棱豆（Psophocarpustetragonolobus），绿豆（Vignaradiata），豆（Vigna unguiculata），Crotalaria paulineaA.2.2试验寄主
试验寄主有3科～9科植物、
豆科：木豆Cajanuscajan、豌豆Pisumsativum、印度麻Crotalariajuncea、Desmodiumcanescens、Sesbaniaeraltata、终车轴草Trifoliumincarnatum，望江南Cassiaoccidentalis。夹竹桃科：长春花Catharanthusroseus。蒙科：藜Chenopodiumalbum，苋色藜Chenopodiumamaranticolor，Chenopodiumcapitatum、昆藜Chenopodium quinoa。
茄科：曼陀罗Daturastramonium、克里夫兰烟Nicotianaclevelandii、矮牵牛Petuniahybrida、普通烟Nicotianatabacum、心叶烟Nicotianaglutinosa。苋科：千日红Gomphrenaglobosa。A.3病害症状
几乎所有的寄主在接种叶上形成褪绿斑或坏死斑，系统症状为斑驳或花叶，幼叶通常形成明显疱状突起、畸形。一些寄主表现系统坏死。在巴西，受侵染的天豆出现植株矮化、芽枯、结荚数减少、产量降低。毛蔓豆出现严重花叶和疱状突起；距瓣豆出现褪绿和花叶症状；藏麻叶片出现褪绿斑驳和畸形或褪绿斑症状；绿豆叶片出现轻花叶和坏死斑症状；豇豆叶片出现褪绿花叶和严重畸形。A.4地理分布
美国、特立尼达（特立尼达和多巴哥共和国）、波多黎各岛、萨尔瓦多、哥斯达黎加、委内瑞拉、苏里南、巴西、秘鲁、墨西哥。
A.5传播途径
机械传播；花粉、种子传播；甲虫传播，主要是叶甲科甲虫传播，大约有1o种，其中Cerotomaruficornis、C.trifurcata是最重要的传播介体。5
SN/T2055—2008
粒体形态
豇豆重花叶病毒粒子为等轴对称二十面体，直径25nm，无包膜6
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