【商检行业标准(SN)】 进出口蜂王浆中硝基呋喃类代谢物残留量的测定液相色谱-质谱/质谱法

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2061—2008
进出口蜂王浆中硝基喃
类代谢物残留量的测定
液相色谱-质谱/质谱法
Determination of nitrofuran metabolites residuesin royal jelly for import and export-HPLC-MS/MS
2008-04-29发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2008-11-01实施
本标准的附录A、附录B为资料性附录前言
本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国浙江出入境检验检疫局。本标准主要起草人：陈笑梅、刘海山、谢文、单慧君、俞春燕、杨磊、钱艳、吴娟。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。SN/T2061—2008
1范围
进出口蜂王浆中硝基喃
类代谢物残留量的测定
液相色谱-质谱/质谱法
SN/T2061—2008
本标准规定了蜂王浆中呋喃唑酮代谢物3-氨基-2-嗯唑烷酮（3-Amino-oxazolidin-2-one，AOZ）、它酮代谢物3-氨基-5-吗啉代甲基-2-嗯唑烷酮（3-Amino-5-morpholinomethyl-oxazolidin-2-oneAMOZ）、呋喃西林代谢物氨基脲（semicarbazide，SEM)和呋喃妥因代谢物1-氨基乙内酰脲（1-aminohydantoin，AHD)质谱/质谱测定方法。本标准适用于蜂王浆中AOZ、AMOZ、SEM和AHD残留的定性确证和定量测定2方法提要
样品经稀盐酸水解蛋白结合态中的硝基呋喃代谢物，用2-硝基苯甲醛（2-NBA）衍生化，三氯乙酸沉淀去除蛋白质，调pH值7.5后，清液过HLB小柱净化，分析物采用液相色谱-串联质谱测定，内标法定量。
3试剂和材料
除另有规定外，试剂均为分析纯，水为超纯水。3.1甲醇：色谱纯。
3.2乙睛：色谱纯。
3.3乙酸乙酯：色谱纯。
邻硝基苯甲醛（2-NBA)。
二甲亚砜：色谱纯。
3.6乙酸铵：色谱纯
3.75mmol/L乙酸铵水溶液：称取0.19g乙酸铵溶于适量水中，再定容到500mL。3.850%三氯乙酸：称50g三氯乙酸，加50g水溶解。3.91mol/L氢氧化钠溶液：称取40g氢氧化钠，用水溶解定容至1000mL。3.102-NBA衍生剂（50mmol/L）：称取0.0378g邻硝基苯甲醛到烧杯中，加入5mL二甲亚溶解，该溶液的浓度为50mmol/L，现配。3.110.1mol/L磷酸氢二钾：称取8.71g无水磷酸氢二钾，加入500mL水溶解。3.120.2mol/L盐酸溶液：量取17mL浓盐酸用水定容至1000mL。3.130.2%乙酸-乙腈（7+3.体积比）：0.2%乙酸70mL与30mL乙腈混匀。3.14标准溶液配制
3.14.1硝基呋喃类代谢物标准品：AOZ、SEM·HCI、AHD·HCI、AMOZ纯度均大于99%。3.14.2硝基哺类代谢物同位素标准品：AOZ-D纯度大于98%，SCA-1Nz-1\C·HC纯度大于99%.AHD-1\C纯度大于98%.AMOZ-D，纯度大于98%。3.14.3标准储备液：分别称取适量AOZ、AMOZ、SEM·HCI和AHD·HCI硝基呋哺代谢物标准，用甲醇溶解并定容1.0mg/mL,0℃~4℃保存，有效期6个月。3.14.4混合标准溶液：分别准确移取适量1.0mg/mLAOZ、SEM、AHD、AMOZ标准储备液（3.16），1
SN/T2061—2008
用甲醇稀释定容至10ng/mL0℃~4℃保存，有效期7d。3.14.5同位素内标储备液：分别称取适量AOZ-D1、AHD-13Cs、AMOZ-D，和SCA-15N-13C·HCI硝基呋腩代谢物同位素标准品，用甲醇溶解并定容到25mL棕色容量瓶中，该溶液浓度为1.0mg/mL，0℃~4℃保存。
3.14.6混合同位素内标溶液：分别准确移取适量1mg/mLAOZ-D4、SCA-15Nz-13C、AHD-13C3、AMOZ-D，储备液（3.14.3），用甲醇稀释定容为10ng/mL，0℃～4℃保存。3.14.7混合标准工作溶液：分别取混合标准溶液（3.14.4）0μL，60μuL，100μL，200uL，400μL，1000μL。加入混合同位素内标溶液（3.14.6)200μL，3mL0.2mol/L稀盐酸和100μL2-NBA衍生剂，混匀后37℃放置过夜。用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH7.5士0.2.5mL乙酸乙酯液液萃取.将有机相在40℃氮吹至干后用1.0mL0.2%乙酸-乙睛（7十3，体积比）（3.13）溶解残渣：该混合标准工作溶液相当于样品中含有0μg/kg.0.3μg/kg.0.5μg/kg.1.0μg/kg.2.0μg/kg.5.0μg/kg的硝基呋代谢物残留。
3.15HLB小柱：OASISHLB小柱，60mg.3mL或相当者。使用前用5mL甲醇和5mL水预淋洗。4仪器和设备
4.1液相色谱-质谱/质谱联用仪：配有电喷雾源（ESI）。4.2旋转浓缩器。
4.3混匀器。
4.4真空固相萃取装置。
4.5pH计：测量精度士0.02。
4.6浓缩瓶：100mL。
4.7具盖塑料离心管：50mL。
4.8离心机：4000r/min。
4.9烘箱。
5试样制备与保存
取500g代表性蜂王浆样品，在室温下解冻，等样品全部融化后搅匀，将试样均分成两份，分别装入样品瓶中，密封，并标明标记。一份作为试验样，另一份在一18℃保存。在制样的操作过程中，应防止样品污染或发生残留物含量的变化。6测定步骤
6.1提取和净化
称取混匀的蜂王浆样品2g（精确至0.01g）于50mL具盖塑料离心管中，分别加入200uL混合同位素内标溶液（3.14.6），25mL0.2mol/L盐酸溶液和100uL2-NBA衍生剂（3.10），混勾后放人37℃士2℃烘箱内，避光放置过夜。加1.0mL50%三氯乙酸，轻轻混匀后，4000r/min离心5min，将上清液过滤。滤液用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH7.5土0.2，过经预淋洗的HLB小柱（3.15），再加10mL水清洗HLB小柱，用10mL乙酸乙酯洗脱，收集洗脱液，40℃以下真空浓缩至干后，用1.0mL0.2%乙酸-乙睛（7+3，体积比）（3.13）溶解残渣，过0.45m的滤膜，滤液供液相色谱串联质谱测定。6.2测定
6.2.1液相色谱串联质谱条件
a）色谱柱Cg150mm×5mm，5μm或相当者；b)
流动相梯度洗脱条件见表1；
流速300μL/min；
进样量：30μL；
离子源：电喷雾离子源；
扫描方式：正离子扫描；
检测方式：多反应监测（MRM）；分辨率：单位分辨；
其他参考条件参见附录A。
表1梯度洗脱条件
时间/min
6.2.2液相色谱/串联质谱测定
乙睛/%
SN/T 2061—2008
5mmol/L醋酸铵水溶液/%
根据试样中被测样液的含量情况，选取响应值相近的标准工作液进行色谱分析。标准工作液和样液中待测物的响应值均应在校正曲线线性响应范围内，如果超出，应稀释。在上述色谱条件下SEM、AHD、AMOZ和AZO的参考保留时间分别约为9.8min、10.1min、10.7min和11.2min，四种硝基喃代谢物标准品多反应监测（MRM)色谱图参见附录B中图B.1。6.2.3定性测定
按照上述条件测定样品和标准工作溶液，如果样品的质量色谱峰保留时间与标准品一致，允许偏差小于土2.5%；定性离子对的相对丰度与浓度相当的标准工作溶液的相对丰度一致，相对丰度允许偏差不超过表2规定的范围，则可判断样品中存在相应的被测物，表2定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度/%
允许的相对偏差/%
6.2.4定量测定
按照内标法进行定量计算。
6.2.5空白试验
除不加试样外，均按上述操作步骤进行。结果计算和表述
≥50~20
≥20~10
用色谱数据处理机或用式(1)计算试样中硝基呋喃代谢物残留含量：X=
式中：
试样中被测组分的残留量；
样品溶液中内标物的浓度；
cXAXcXAXV
AXcaXAXm
样品溶液中待测组分的峰面积；样品溶液中内标物峰面积；
标准溶液的浓度；
标准溶液中内标物的浓度；
标准溶液峰面积；
标准溶液中内标物峰面积；
...（1)
SN/T2061—2008
样品溶液最终定容的体积；
样品溶液所代表的试样质量，单位为克（g）。测定低限、回收率
测定低限
硝基呋哺类代谢物残留测定低限均为0.5ug/kg。8.2
回收率
在蜂王浆样品中添加硝基呋哺类代谢物浓度在0.5μg/kg，1.0μg/kg、2.0μg/kg时，回收率见表3。
蜂王浆中硝基呋哺类代谢物测定回收率范围添加浓度
0.5μg/kg
87.6%~104.0%
87.2%~100.4%
91.6%~103.2%
91.6%~104.2%
1.0μg/kg
89.1%106.0%
87.6%~102.0%
90,7%~104.0%
89.6%~105.0%
2.0 μg/kg
91.0%~106.0%
84.0%~97.0%
87.5%104,0%
88.0%~101.0%
附录A
（资料性附录）
API4000LC-MS/MS系统电喷雾离子源参考条件1监测离子对及电压、气压参数：a)
气帘气压力（CUR）：172.375kPa(25Psi)；雾化气压力（GS1)：289.59kPa（42Psi)；辅助气压力(GS2)：310.275kPa（45Psi)；电喷雾电压（IS)：4800V；
离子源温度（TEM）TEM：540℃；碰撞气压力（CAD)：34.475kPa(5Psi)；EP电压：9V；
离子对、DP、CE和 CXP 见表 A. 1。离子对、DP、CE和CXP
SEM-NBA
SCA-N,-\C-NBA
AHD-NBA
AHD-13C--NBA
AMOZ-NBA
AMOZ-D-NBA
AOZ-NBA
AOZ-D,-NBA
a为定量离子对。
定性离子对
209.2/166.2
209.2/192.2
212.2/168.2
249.2/134.1
249.2/104.1
252.2/134.2
335.2/262.3%
335.2/291.3
340.3/296.4
236.2/134.2
236.2/104,1
240.2/134.2
保留时间
去簇电压
(DP)/V下载标准就来标准下载网
碰撞气能量
(CE)/V
SN/T 2061—2008
碰撞室出口
电压(CXP)/V
非商业性声明：附录A所列参数是在API4000质谱仪完成的·此处列出试验用仪器型号仅是为了提供参考，并不涉及商业目的，鼓励标准使用者尝试不同厂家和型号的仪器。5
SN/T 2061—2008
209.2/102.2
:3000-
售600
附录B
（资料性附录）
硝基呋哺类代谢物标准品多反应监测（MRM)色谱图7820
6000209.2/166.2
sda/asora
249.2/134.1
9.931.10.60
. 00 e
335.2/262.3
236. 2/134. 2
3000[249. 2/104. 1
sda/insur
212. 2/168. 2
252.2/134.2
9. 33[11. 58
335.2/291.3
5. 0e* - 236. 2/104. 1
11.419.05
2. 5e* 340. 3/296.4
9.97.111.50
1.0ct 240.8/134.2
硝基呋喃类代谢物标准品（2.0μg/kg）和同位素内标（1.0μg/kg）多反应监测（MRM）色谱图Foreword
AnnexA，annexBof thisstandardareboth informativeannexesSN/T2061—2008
This standard is proposed by and is under the charge of Certification and Accreditation Administra-tionofthePeople'sRepublic of China.This standard isdraftedby Zhejiang Entry-Exit Inspectionand Quarantine Bureau of the People's Re-public of China.
The main drafters of this standard are Chen Xiaomei,Liu Haishan,Xie Wen,Shan Huijun,Yu Chun-yan,Yang Lei, Qian Yan,Wu Juan.This standard is a professional standard for entry-exit inspection and quarantine promulgated for thefirst time.
Note：This EnglishVersion,a translation from the Chinesetext,is solelyforguidance,7
SN/T2061—2008
Determinationof nitrofuran metabolites residues in royaljellyforimportandexport-HPLC-MS/MS1
This standard specifies the method of determination of furazolidone metabolite 3-Amino-oxazolidin-2-one(AoOz),furaltadone metabolite 3-Amino-5-morpholinomethyl-oxazolidin-2-one（AMOz),nitrofurazonemetabolitesemicarbazide(SEM).andnitrofurantoinmetabolite1-aminohydantoin(AHD)residues in royal jelly by high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometryThis standard is applicable to thequantify and confirm of AOZ,AMOZ,AHD.SEM residues in royaljelly.
2Principle
Protein in sample need to be precipitated by trichloroacetic acid solution after combined hydrolysis ofthe protein-bound nitrofuran metabolites and derivatisation of the resulting metabolites with 2-nitrobenzaldehyde(NBA)during an overnight incubation.Adjust the solution to pH7.5and clean up byHLBcartridge.Itwasdetermined and confirmedbyhigh-performance liquidchromatography-tandemmass spectrometry.Internal standard method was used to quantify.Reagents andmaterials
Unless specified notes.all reagents should be analytical grade,\water\is redistilled or deionized.3.1
Methanol:HPLCgrade
Acetonitrile：HPLCgrade
Ethylacetate：HPLCgrade
2-Nitrobenzaldehyde(2-NBA).
Dimethyl sulfoxide:HPLCgradeAmmoniumacetate：HPLCgrade
5mmol/LAmmoniumacetate solution:Dissolve0.19gAmmoniumacetatein500mLwater50%Trichloroacetic acid solution:Dissolve 50 g trichloroaceticacid in 50mL water.1mol/LSodiumhydroxidesolution:Dissolve40 g sodiumhydroxidein1000 mLwater.SN/T2061—2008
3.102-NBA solution(50 mmol/L).Dissolve 0.0378 g 2-nitrobenzaldehyde in 5mL dimethyl sul-foxide.preparedfreshly.
0.1mol/LDipotassium hydrogenphosphate solution:Dissolve8.71g dipotassiumhydrogen3.11
phosphateanhydrous in50omLwater.3.12
Hydrochloricacid(0.2mol/L):Dilute17mLhydrochloricacidto1000mLwithwater.3.13
0.2%Aceticacid-acetonitrile(7+3.V/V):Mix70mL0.2%aceticacidwith30mLacetoni-trile.
Standard solution Preparation:3.14.1
Nitrofuranmetabolitesstandard:AOZ,SEM·HCl,AHD·HCl,AMOZ.purity>99%Nitrofuran metabolites isotope standard:AOz-D4purity>98%,AHD.13Cspurity>98%AMOZ-D,purity>98%.SCA.15N2-13C·HClpurity>99%.3.14.3Nitrofuranmetabolites standard stock solution:Accuratelyweighan appropriate amount ofAOZ,AMOZ,SEM·HCI andAHD·HCl,and dissolvewith methanoltopreparea standard stock so-lution of 10 ng/mL.This standard stock solution should be stored at o℃ ~4℃ and stable for6months.
3.14.4Nitrofuran metabolites mix standard solution:According to the requirement,pipette adequate amount of standard stock solution(3.14.3)and dilute with methanol to preparemix standardinterim solution of 10 ng/mL.This standard stock solution should be stored at 0℃~4℃ and stablefor7d.
Nitrofuran metabolites isotope standard stock solution:Accurately weighanappropriate3.14.5
amount of AOZ-D4,SCA-15N2-13C:HCl,AHD-13Cg andAMOZ-Ds,and dissolvewith methanol to pre.pare an isotope standard stock solution of 1.O mg/mL. This isotope standard stock solution shouldbe stored at o℃~4℃.
3.14.6Nitrofuran metabolites mix isotope standard solution: According to the requirement, pi-pette adequate amount of isotope standard stock solution(3.14.5) and dilute with methanol to pre-pare mix isotope standard interim solution of 10 ng/mL.This isotope standard stock solution shouldbestoredat0℃~4℃.
Nitrofuran metabolites mix standard working solution:Pipette 0,60,100.200.400,1 000 μL nitrofuran metabolites mix standard solution (3.14.4) in six centrifuge tubes. Add 200 μL10 ng/mL nitrofuran metabolitesmix isotope standard solution (3.14.6),3 mL 0.2 mol/L HCl(3.11)and 100μL2-NBA solution(3.4)in each tube,shake the centrifugetube with vortexmixerand placeit in an oven at 37℃ , and keep away from light overnight. Adjust the pH of the solution to 7. 5 ±0.2with1 mol/L sodiumhydroxide solution. Extract the solution with5 mL ethyl acetate,evapo-rate theorganic phasebynitrogen evaporatorat 40C.Dissolve the residue with1.0mL0.2%acetic9
SN/T2061—2008
acid-acetonitrile(7+3,V/V)(3.13).Thesixstandardsolutionscorrespond to samplescontaining00.3.0.5.1.0,2.0,5.0μg/kgnitrofuranmetabolites.3.15
HLB cartridge:OASIS HLB Extraction cartridge,60 mg 3 mL,wash the cartridge with5mLmethanol followed by 5 mL water.4
Apparatus and equipment
High-performance liquidchromatography-tandemmassspectrometer.equippedwithelectrospray ion source.
Rotaryevaporator.
Vortexmixer
Solid phase extraction equipment.pHmeter:Accurateto0.02.
Concentratiomflask:100mL.
Plastic centrifugetube:50mL.Centrifuge:4000 r/min.
PreparationandstorageoftestsampleAround 50o g of royal jelly sample isprepared.Melt it at roomtemperatureand mix thoroughly afterthe sample melted.Keep the prepared sample into two sample bottles,seal and label.One is usedastestsampleandtheotheris stored atbelow-18temperature.In the course of samplepreparation,precautions must be taken toavoid contamination or any factorsthatmaycausethechangeof residuecontent6
Determinationprocedure
Extractionand cleanup
Weigh2g royal jelly(accurate to0.01g)into 50 mL centrifuge tube.Add 200μL 10ng/mL nitrofuranmetabolitesmix isotopestandardsolution(3.14.6).Add25mL0.2mol/LHCland100μL2-NBAsolution. Vortex the centrifuge tube and place it in an oven at 37℃ ± 2℃. Keep it away from lightovernight..Add 1.0 mL 50% trichloroacetic acid (3.7),shake the centrifuge tube lightly.Centrifugefor 5 min at 4 000 r/min, filter the supernatant layer. Adjust pH of the filtrate to 7. 5 ± 0. 2 with10
小提示：此标准内容仅展示完整标准里的部分截取内容，若需要完整标准请到上方自行免费下载完整标准文档。