【商检行业标准(SN)】 进出口蜂王浆中大环内酯类抗生素残留量的检测方法液相色谱串联质谱法

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T2062—2008
进出口蜂王浆中大环内酯类抗生素残留量的检测方法
液相色谱串联质谱法
Determination of macrolide antibiotics residues in royal jelly forimport and export-LC-MS/MS method2008-04-29发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2008-11-01实施
本标准的附录A、附录B和附录C均为资料性附录，本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国浙江出入境检验检疫局。本标准主要起草人：谢文、丁慧瑛、奚君阳、钱艳、陈笑梅、黄雷芳、本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准SN/T2062—2008
1范围
进出口蜂王浆中大环内酯类抗生素残留量的检测方法液相色谱串联质谱法SN/T2062—2008
本标准规定了蜂王浆中螺旋霉素、替米考星、竹桃霉素、泰乐菌素、红霉素、罗红霉素、交沙霉素残留量的制样和液相色谱串联质谱测定方法。本标准适用于蜂王浆中螺旋霉素、替米考星、竹桃霉素、泰乐菌素、红霉素、罗红霉素、交沙霉素残留量的检测，
2方法提要
样品用甲醇沉淀蛋白质，在磷酸盐缓冲盐溶液介质下，再用C1固相萃取小柱净化，液相色谱串联质谱测定，外标法定量。
3试剂和材料
除另有规定外，所有试剂均为分析纯，水为二次蒸馏水，3.1乙：高效液相色谱级。
3.2甲醇：高效液相色谱级。
3.3甲酸：高效液相色谱级。
3.4氢氧化钠。
3.5磷酸二氢钠
3.60.1mol/L氢氧化钠溶液：称取4g氢氧化钠，并用水稀释至1L。3.7甲醇水溶液：甲醇-水（2+8，体积比）。3.8磷酸盐缓冲溶液：溶解13.8g磷酸二氢钠于950mL水中，用0.1moL/L氢氧化钠溶液调节溶液pH值到8.0.最后用水稀释至1L。3.9螺旋霉素、替米考星、竹桃霉素磷酸盐、泰乐菌素酒石酸盐、红霉素、罗红霉素、交沙霉素标准品：纯度大于等于95%，参见附录A表A.1。3.107种大环内酯标准储备溶液：称取适量标准品（3.9），分别用甲醇溶解，溶液浓度为100μg/mL，1℃～4℃冰箱保存。有效期三个月3.11标准工作溶液：根据需要用空白样品溶液将标准储备液稀释成2.5ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL的混合标准工作溶液，相当于样品中含有5uμg/kg、10μg/kg、20μg/kg、100μg/kg、200μg/kg大环内酯。3.12C1固相萃取小柱，500mg或相当者，使用前依次用5mL甲醇，5mL水预洗。4仪器和设备
4.1高效液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源。4.2.旋转蒸发器
4.3固相萃取装置。
4.4高速离心机：7000r/min。
4.5pH计。
SN/T2062—2008
4.6旋涡混合器。
4.7氮吹仪。
5试样制备与保存
取500g代表性蜂王浆样品，在室温下解冻，等样品全部融化后搅勾，将试样均分成两份，分别装人样品瓶中，密封，并标明标记。一份作为试验样，另一份在一18℃保存在制样的操作过程中，应防止样品污染或发生残留物含量的变化6测定步骤
6.1提取
称取2g试样（精确到0.01g）置于50mL具塞离心管中，加5mL水，混勾，静置5min，再加甲醇至10.0mL，于旋涡混合器上以2000r/min混匀1min，于6000r/min离心5min，过滤，移取5.0mL滤液，加15mL磷酸盐缓冲溶液（3.8)稀释，混匀。6.2净化bzxZ.net
将溶液转移至固相萃取小柱中（3.12），再用5mL水和5mL甲醇水溶液（3.7)依次洗涤浓缩瓶，洗涤液过固相萃取小柱，弃去流出液，在负压下抽干，用6mL甲醇洗脱，控制流速1mL/min～2mL/min，收集全部洗脱液于10mL离心管中，洗脱液在50℃以下水浴下平缓氮气吹至约1mL，用水定容至2.0mL，混匀，溶液过0.45um，滤膜，供液相色谱-串联质谱仪测定。6.3测定
6.3.1液相色谱-串联质谱条件
色谱柱：Cs柱，5μm，150mmX4.6mm（内径）或相当者：a)
流动相梯度洗脱程序（见表1)；表1梯度洗脱程序
时间/min
流速：400μL/min
进样量：20μL；
离子源：电喷雾离子源；
扫描方式：正离子扫描：
检测方式：多反应监测；
乙腈/%
0.15%甲酸水溶液/%
雾化气、气帘气、辅助气、碰撞气均为高纯氮气；使用前应调节各参数使质谱灵敏度达到检测要求，参考条件参见附录B表B.1；i）
监测离子对（m/z）：螺旋霉素843.6/174.3（定量离子）843.6/318.5：替米考星869.7/174.4（定量离子）、869.7/156.6；竹桃霉素688.6/158.4（定量离子）、688.6/544.6；泰乐菌素916.5/174.2（定量离子）、916.5/772.7；红霉素734.6/158.5（定量离子）、734.6/576.5；罗红霉素837.6/158.4（定量离子）、837.6/679.6；交沙霉素828.8/174.3（定量离子）828.8/229.3。2
6.3.2液相色谱-串联质谱测定
SN/T 2062—2008
根据试样中被测样液的含量情况，选取待测物的响应值在仪器线性响应范围内的浓度进行测定，如超出仪器线性响应范围应进行稀释。在上述色谱条件下螺旋霉素、替米考星、竹桃霉素、泰乐菌素、红霉素、罗红霉素、交沙霉素的参考保留时间分别约为9.2min、9.6min、10.0min、10.2min、10.1min、10.6min和11.0min，标准溶液的选择性离子流图参见附录C中图C.1。6.3.3液相色谱串联质谱确证
按照液相色谱-串联质谱条件测定样品和标准工作溶液，样品中待测物质的保留时间与标准溶液中待测物质的保留时间偏差在土2.5%之内。定量测定时采用标准曲线法测定。定性时应当与浓度相当标准工作溶液的相对丰度一致，相对丰度允许偏差不超过表2规定的范围，则可判断样品中存在对应的被测物。
表2定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度/%
允许的相对偏差/%
6.3.4空白试验
除不加试样外，均按上述操作步骤进行。结果计算和表述
>20~50
>10~20
用色谱数据处理机或按式（1)计算试样中大环内酯的残留含量，计算结果需扣除空白值：GXV
式中：
试样中大环内酯类抗生素残留量，单位为微克每千克（ug/kg）；Gi
从标准曲线上得到的大环内酯类抗生素残留量的溶液浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；V
样液最终定容体积，单位为毫升（mL）；最终样液代表的试样质量，单位为克（g）。m
方法的测定低限（LOQ）和回收率8
8.1测定低限
大环内酯类抗生素残留量测定低限为10μg/kg。8.2回收率
回收率见表3。
表3回收率的实验数据（在不同添加浓度范围内）化合物
螺旋霉素
替米考星
竹桃霉素
添加浓度/（μg/kg）
回收率范围/%
74.9~105.0
72.0~102.0
73.5~105.3
74.9~100.4
77.0~105.5
72.3~103.2
71.6~1025.2
72.5~102.0
73.9~105.3
SN/T2062—2008
化合物
泰乐菌素
红霉素
罗红霉素
交沙霉素
表3（续）
添加浓度/（μg/kg）
回收率范围/%
70.1~100.2
72.5~100.5
74.3~100.3
72.7~104.1
76.5~106.5
78.9~106.4
72.5~102.6
74.5~109.5
71.0~105.3
80.1~104.5
71.5~102.5
73.2~104.3
标准物质
螺旋霉素
替米考星
竹桃霉素磷酸盐
泰乐菌素酒石酸盐
红霉素A二水合物
罗红霉素
交沙霉素
附录A
（资料性附录）
大环内酯标准品信息
英文名称
Spiramycin
Tilmicosin
7种大环内酯标准品信息
8025-81-8
108050-54-0
Oleandomycin phosphate
Tylosin tartrate
Erythromycin
Roxithromycin
Josamycin
7060-74-4
74610-55-2
59319-72-1
80214-83-1
16846-24-5
SN/T2062—2008
分子式
CasHaN.Or.
CasHsuN,Ors
CaHaNO12XH,PO,X2H20
Cao Ha NO2a
CaHeNO
CH NOns
SN/T2062—2008
离子源参考条件：
附录B
（资料性附录）
API4000LC-MS/MS系统电喷零离子源参考条件)电喷雾电压（IS）：4800V；
雾化气压力（GSI）：262.01kPa(38Psi)；气帘气压力（CUR）：186.165kPa(27Psi）；辅助气流速（GS2）：310.275kPa（45Psi）；离子源温度（TEM）：540℃
碰撞气(CAD)：41.37kPa(6Psi)；离子对、去簇电压(DP)、碰撞气能量（CE)及碰撞室出口电压(CXP)见表B.1。表B.1离子对、去簇电压、碰撞气能量和碰撞室出口电压名称
螺旋霉素
替米考星
竹桃霉素
泰乐菌素
红霉素
罗红霉素
交沙霉素
a为定量离子对。
离子对m/z
843.6/174.3
843.6/318.5
869.7/174.4°
869.7/156.6
688.6/158.4
688.6/544.6
916.5/174.2
916.5/772.7
734.6/158.5
734.6/576.5
837.6/679.6
837.6/158.4
828.8/174.3
828.8/229.3
去簇电压(DP)/V
碰撞气能量（CE)/V
碰撞室出口电压
(CXP)/V
1）非商业性声明：附录表A所列参数是在AP14000质谱仪完成的·此处列出试验用仪器型号仅是为了提供参考，并不涉及商业目的，鼓励标准使用者尝试不同厂家和型号的仪器。6
附录C
（资料性附录）
SN/T 2062—2008
螺旋雷素、替米考星、竹桃雷素、泰乐菌素、红雷素、罗红雷素、交沙雷素标准品选择性离子流图2.0
H2H. H/174. 3
8. 26 8.h2 9,19 10.0110. 5310.73/11o
11, h2
8y.6/6Y9.6
6.61 7, 03 7. 17 8, 01 5. 96.9.44, 4. 7210.39 1 11. 0711
t/rnin
734.4/158.5
9. a:s 9 67 F 10. 84,11. 26 11. 96 12. ur: j3, 5010
10, 20
916.5/174.2
688.6/158.4
12：43.1413.38
9, 319 9. 83 k 10. 65 151. 8412. 198
B69.7/174. 4
12.721:5.
843. 6/174. 3
10. 00 10. 67 11, 35
图C.1螺旋霉素、替米考星、竹桃霉素、泰乐菌素、红霉素、罗红霉素、交沙霉素（5ng/mL）的标准品的选择性离子流图SN/T2062—2008
Foreword
AnnexA,AnnexBandAnnexC of thisstandardareinformativeannex.This standard was proposed by and is under the charged of certification and accreditation administa-tionofthePeople'sRepublicofChina.This standard was drafted by Zhejiang Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau of the People'sRepublic of China
The standard was mainly drafted by Wen Xie,Hui-yin Ding,Jun-yang Xi,Yan Qian,Xiao-mei ChenLei-fang Huang.
This standard is a professional standard for entry-exit inspection and quarantine promulgated for thefirst time.
Note:This English Version.a translation from the Chinese text,is solelyfor guidance.oo
SN/T 2062—2008
Determinationofmacrolideantibioticsresidues inroyaljellyforimportandexportLC-MS/MS
Thestandard specifiesthemethodsof samplepreparationand determinationbyLC-MS/MSof spira-mycin,tilmicosin,oleandomycin,tylosin,erythromycin,roxithromycin.josamycin residues in royaljelly.
This standard is applicable to the determination of spiramycin,tilmicosin,oleandomycin,tylosinerythromycin,roxithromycin,josamycinresiduesinroyaljellysample.2Principle
Methanol is used to precipitate protein.The solution is diluted with sodium dihydrogen phosphatebuffer,and cleaned up with Cia column. Finally it is determined by LC-MS/MS.External standardmethod is used.
Reagentsandmaterials
Unless otherwise specifiedall the reagent used should be analytical grade,\water\is double distilledwater.
Acetonitrile:HPLCgrade
Methanol:HPLCgrade
Formicacid:HPLCgrade
Sodiumhydroxide
Sodiumdihydrogenphosphate.
O.1mol/LNaOHsolution:Dissolve4gsodiumhydroxidein1Lwater.Methanolwatersolution：Methanol-water(2+8,V/V)9
SN/T2062—2008
Sodiumdihydrogenphosphatebuffer:Dissolve13.8gsodiumdihydrogenphosphatein950mL3.8
water,adjusttopH8.0with0.1mol/LsodiumhydroxideSpiramycin,tilmicosin,oleandomycin(phosphate salt)，tylosin（tartrate salt)erythromycin3.9
roxithromycin.josamycin:purity≥95%.SeetableA.1inannexAStock standard solution of seven macrolide antibiotics:accurately weigh appropriate standard3.10
(3. 9),dissolve with methanol individually,the concentration of solutions is 100 μg/mL. It should bestoredat1℃ ~4℃ in refrigerator.Stock standard solution isstablefor3months3.11
Calibration curve standard working solutions:Working solutions were prepared in methanol atfiveconcentrationlevels,2.5ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100μg/mL.Itissameas5μg/kg.10μg/kg,20μg/kg.100μg/kg.200μg/kgsevenmacrolideantibiotics insample3.12
Cis column:500mg,or equivalent.It is conditionedwith5mLmethanolfollowedby5mL water.4
Apparatusandequipment
Liquidchromatograhywithelectrospray ionizationmass spectrometryRotaryvacuumevaporator.
SPE-12GColumnProcessor.
Highspeedcentrifuge:7o0or/min.pHmeter.
Vortexmixer
Nitrogenevaporator
Preparationoftestsample
Royal jelly is about 5o0 g.The sample is melted under room temperature.Keep the prepared sampleinto two sample bottles, seal and label. The test sample is stored at room temperature, The restsampleisstored in-18℃refrigerator.In the course of sample preparation,precautions must be taken to avoid contamination or any factors,whichmaycausethechangeof residuecontent.10
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