【商检行业标准(SN)】 进出口动物源食品中14种β-内酰胺类抗生素残留量检测方法液相色谱-质谱/质谱法

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T2050—2008
进出口动物源食品中14种B-内酰胺类抗生素残留量检测方法
液相色谱-质谱/质谱法
Determination of 14 beta-lactam antibiotic residues infoodstuffs of animal origin for export and import-LC-MS/MS method
2008-04-29发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2008-11-01实施
中华人民共和国出人境检验检疫行业标准
进出口动物源食品中14种β-内酰胺类抗生素残留量检测方法
液相色谱-质谱/质谱法
SN/T2050—2008
中国标准出版社出版
北京复兴门外三里河北街16号
邮政编码：100045
网址spc.net.cn
电话：68523946
68517548
中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*
开本880×1230
2008年8月第一版
印张1.75
字数45千字
2008年8月第一次印刷
印数1—2000
书号：155066·2-18934
定价14.00元
-TKANiKAca
本标准的附录A和附录B为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准由中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局负责起草。本标准主要起草人：林维宣、李一尘、于灵、隋凯、田苗、杨春光、徐风敏、王宏伟本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准SN/T2050—2008
1范围
进出口动物源食品中14种β-内酰胺类抗生素残留量检测方法
液相色谱-质谱/质谱法
HiiKANiKAca
SN/T2050—2008
本标准规定了动物源食品中羟氨青霉素、氨芋青霉素、邻氯青霉素、双氯青霉素、乙氧萘胺青霜素、苯唑青霉素、芋青霉素、苯氧甲基青霉素、苯咪青霉素、甲氧苯青霉素、苯氧乙基青霉素、头抱氨芋、头孢吡嘛、头孢唑嘛共14种β内酰胺类抗生素液相色谱串联质谱测定方法本标准适用于动物肌肉、肝脏、肾脏、牛奶和鸡蛋中14种β内酰胺类抗生素残留量的检测和确证。2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682—1992，neqISO3696：1987）3方法提要
样品中β内酰胺类抗生素残留物用乙睛-水溶液提取，旋转蒸发除去提取液中乙睛，加人磷酸盐缓冲溶液。提取液用HLB固相萃取柱净化，洗脱液氮气吹干后，用液相色谱串联质谱测定，外标法定量4试剂和材料
除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。4.1乙睛：高效液相色谱级。
4.2甲醇：高效液相色谱级。
4.3甲酸：高效液相色谱级。
4.4、氯化钠。
4.5氢氧化钠。
4.6磷酸二氢钾。
4.7磷酸氢二钾。
3固相萃取小柱：WatersoasisHLB固相萃取小柱，500mg，6mL或相当者。使用前用2mL甲醇，1mL水预处理，
4.90.1mol/L氢氧化钠：称取4g氢氧化钠，并用水稀释至1000mL。4.10乙睛-水溶液：（15+2.体积比）。4.11乙睛-水溶液：（30+70，体积比）。4.120.05mol/L磷酸盐缓冲溶液（pH8.5）。称取8.7g磷酸氢二钾，超纯水溶解，稀释至1000mL，调节pH至8.5士0.1。
4.130.025mol/L磷酸盐缓冲溶液（pH7.0）。称取3.4g磷酸二氢钾，超纯水溶解，稀释至1000mL，调节pH值至7.0士0.1。
4.140.01mol/L乙酸铵溶液（pH=4.5）：称取0.77g乙酸铵，超纯水溶解、稀释至1000mL，用甲酸SN/T2050—2008
调节pH至4.5士0.1。
4.15羟氨苄青霉素、氨苄青霉素、邻氯青霉素、双氯青霉素、乙氧萘胺青霉素、苯唑青霉素、苄青霉素、青霉素V、苯咪青霉素、甲氧苯青霉素、苯氧乙基青霉素、头孢氨芒、头孢吡啉、头孢唑啉标准品：纯度均大于等于95%。
4.16标准储备溶液：分别称取约0.01g（精确至0.0001g）标准品，分别用乙睛-水溶液（4.11)溶解定容至100mL，此标准溶液浓度为约为100ug/mL，置于一18℃冰箱避光保存。保存期5d。4.17混合标准中间液：分别吸取适量的14种3内酰胺类抗生素的标准储备液于100mL容量瓶中，用磷酸盐缓冲溶液（4，13）定容至刻度，配成混合标准中间液。使得混合标准中间液中羟氨芋青霉素500ng/mL，氨芋青霉素200ng/mL，苯咪青霉素100ng/mL，甲氧苯青霉素10ng/mL，青霉素100ng/mL，苯氧甲基青霉素50ng/mL，苯唑青霉素200ng/mL，苯氧乙基青霉素1000ng/mL，邻氯青霉素100ng/mL，乙氧萘青莓素200ng/mL，双氯青霉素1000ng/mL，头抱氨竿200ng/mL，头抱匹林100ng/mL，头孢唑啉50ng/mL。置于一4℃冰箱避光保存。保存期5d。4.18混合标准工作液：精密量取标准中间溶液（4.17)适量，用空白样品基质配制成不同浓度系列的混合标准工作溶液（用时现配）。5仪器和设备
5.1高效液相色谱-质谱/质谱仪：配有电喷雾离子源。5.2旋转蒸发器。
5.3固相萃取装置。
5.4离心机。
5.5均质器。
5.6旋涡混合器。
5.7pH计。
5.8氮吹仪。
6样品制备与保存
动物肝脏、肾脏、肌肉组织
取约500g代表性样品.用组织捣碎机充分捣碎，均分成两份，分别装入洁净容器中，密封·并标明标记，于一80℃以下冷冻存放。6.2鸡蛋
取约500g代表性样品，去壳，用搅拌机充分均勾，均分成两份，分别装人洁净容器中，密封，并标明标记，于一80℃以下冷冻存放。6.3奶
所取约500g样品，充分均匀，均分成两份，分别装入洁净容器中，密封，并标明标记，于一80℃以下冷冻存放。
7测定步骤
7.1提取
7.1.1、肝脏、肾脏、肌肉组织、鸡蛋样品称取已粉碎样品5g（精确至0.01g）于一50mL离心管中，加15mL乙晴-水溶液（4.10），均质30s后，在4000r/min下离心5min，将上清液转移至另一50mL离心管中，用玻棒捣碎离心管中的沉淀。另取一50mL离心管，加人10mL乙睛-水溶液（4.10），洗涤均质器刀头，将洗涤液倒人前述离心管中，将离心管经旋涡混合1min后，在4000r/min下离心5min，合并上清液。用10mL乙晴-水溶液2
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SN/T2050—2008
（4.10）重复上述操作，合并上清液，用乙睛-水（4.10）定容至40mL刻度离心管中，准确移取20mL提取液于100mL棕色鸡心瓶。
7.1.2牛奶样品
称取10g（精确至0.01g）试样于一50mL离心管中，加入20mL乙睛，均质30s后，在4000r/min下离心5min，将上清液转移至另一50mL离心管中，用玻棒捣碎离心管中的沉淀。另取一离心管，加入10mL乙睛-水溶液（4.10），洗涤均质器刀头，将洗涤液倒人前述离心管中，将离心管旋涡混匀1min后，在4000r/min下离心5min，合并上清液。用10mL乙晴-水溶液（4.10）重复上述操作，合并上清液，用乙睛水（4.10)定容至50mL刻度离心管中，准确移取25mL提取液于100mL棕色鸡心瓶。将鸡心瓶于旋转蒸发器上（37℃水浴）蒸发除去乙睛至近干（易起沫样品可加人4mL饱和氯化钠溶液）。此为提取液。
7.2净化
在提取液中加入25mL磷酸盐缓冲溶液（4.12），涡旋混匀1min，用0.1mol/L氢氧化钠溶液调节pH至8.5。将固相萃取柱安装在固相萃取装置上，用前用2mL甲醇.1mL水预处理，将提取液以1mL/min的流速上样。用4mL磷酸盐缓冲溶液（4.12）淋洗2次，再用1mL超纯水淋洗。用3mL乙睛洗脱（速度控制在1mL/min），洗脱液收集于10mL玻璃试管中。将洗脱液于45℃下氮气吹于，用0.025mol/L磷酸盐缓冲溶液（4.13)定容至刻度1mL。过0.45um滤膜后，立即用液相色谱-质谱/质谱测定。
7.3测定
7.3.1液相色谱条件
7. 3. 1. 1
色谱柱：COSMOSILCi8柱，250mm长，内径4.6mm，粒度5um或相当者流动相：A组分是0.01mol/L乙酸铵溶液（甲酸调pH4.5）；B组分是乙腈。梯度洗脱程序7.3.1.2
见表1。
表1梯度洗脱程序
时间/min
流速：1.0mL/min。
7.3.1.4进样量：100μL。
7.3.2质谱条件
7.3.2.1离子源：电喷雾离子源。7.3.2.2扫描方式：正离子扫描。7.3.2.3检测方式：多反应监测。流速/（mL/min）
组分A/%
组分B/%
7.3.2.4雾化气、气帘气、辅助气、碰撞气均为高纯氮气：使用前应调节各参数使质谱灵敏度达到检测要求，参考条件参见附录A
7.3.3高效液相色谱串联质谱测定根据试样中被测物的含量情况，选取响应值相近的标准工作液一起进行色谱分析。标准工作液和待测液中β内酰胺类抗生素的响应值均应在仪器线性响应范围内。对标准工作液和样液等体积进行测3
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定。在上述色谱条件下，14种β内酰胺类抗生素的参考保留时间分别约为：羟氨苄青霉素8.6min，氨芊青霉素11.2min头孢氨芊11.5min，头孢匹啉12.9min，头孢唑啉13.5min.苯咪青霉素16.6min，甲氧苯青霉素16.9min，芒青霉素18.1min.苯氧甲基青霉素19.4min，苯唑青霉素20.3min，苯氧乙基青霉素20.5min，邻氯青霉素21.5min，乙氧萘青霉素22.5min，双氯青霉素23.4min。标准溶液的选择性离子流图参见附录B中图B.1。7.3.4定性测定
按照液相色谱-质谱/质谱条件测定样品和标准工作溶液，如果检测的质量色谱峰保留时间与标准品一致，定量测定时采用标准曲线法测定。定性时应当与浓度相当标准工作溶液的相对丰度一致，相对丰度允许偏差不超过表2规定的范围，则可判断样品中存在对应的被测物。表2定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度/%
允许的相对偏差/%
7.3.5空白试验
除不加试样外，均按上述操作步骤进行。8
结果计算和表述
>20~50
>10～20
用色谱数据处理机或按式(1)计算试样中β内酰胺类抗生素残留含量，计算结果需扣除空白值：X=CXV
式中：
一试样中被测组分含量，单位为微克每千克（ug/kg)；从标准曲线上得到的被测组分残留量溶液浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL)；样液最终定容体积，单位为毫升（mL）：m
最终样液代表的试样质量，单位为克（g）9方法的测定低限（LOQ)和回收率9.1测定低限
.（1)
14种β-内酰胺类抗生素的测定低限分别为羟氨苄青霉素5ug/kg，氨芒青霉素2ug/kg，头孢氨2μg/kg，头孢匹啉1μg/kg，头孢唑啉0.5μg/kg，苯咪青霉素1μg/kg，甲氧苯青霉素0.1ug/kg，青霉素1μg/kg，苯氧甲基青霉素0.5uμg/kg，苯唑青霉素2μg/kg，苯氧乙基青霉素10μg/kg，邻氯青霉素1μg/kg，乙氧萘青霉素2μg/kg，双氯青霉素10uμg/kg。9.2回收率
回收率见表3。
表3回收率
化合物
羟氨芋青霉素
氨芋青霉素
添加浓度
(μg/kg)）
平均回收率/%
化合物
头孢氨芋
头孢匹
头孢唑啉
苯咪青霉素
甲氧苯青霉素
芋青霉素
苯氧甲基青霉素
苯唑青霉素
苯氧乙基青霉素
邻氯青霉素
乙氧萘青霉素
双氯青霉素
添加浓度
(μg/kg)
表3（续）
平均回收率/%
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SN/T2050—2008
SN/T2050—2008
质谱参考参数：
电喷雾电压（IS）：5500V；
附录A
（资料性附录）
质谱参考参数
雾化气压力（GS1)：0.483MPa(70Psi)；气帘气压力（CUR）：0.207MPa（30Psi)：辅助气压力（GS2）)：0.621MPa（90Psi)；离子源温度（TEM）：700℃
14种β内酰胺类抗生素的定性离子对、定量离子对、去簇电压（DP）、碰撞气能量（CE）及碰撞室出口电压（CXP)见表A.1。
定性离子对、定量离子对、去簇电压、碰撞气能量和碰撞室出口电压组分名称
羟氨莘青霉素
氨莘青霉素
头孢氨芋
头孢匹啉
头孢唑
苯咪青霉素
甲氧苯青霉素
芋青霉素
苯氧甲基青霉素
苯唑青霉素
定性离子对
366/349
366/208
350/106
350/192
348/158
348/174
348/191
424/292
424/152
424/320
455/323
455/155
455/295
462/218
462/246
381/165
381/222
335/160
335/175
351/160
351/192
402/160www.bzxz.net
402/243
定量离子对
366/349
350/106
348/158
424/292
455/323
462/218
381/165
335/160
351/160
402/160
去簇电压
(DP)/V
碰撞气能量
(CE)/V
碰撞室出口电
压(CXP)/V
组分名称
苯氧乙基青霉素
邻氯青霉素
乙氧萘青霉素
双氯青霉素
定性离子对
387/182
387/228
436/277
436/160
415/199
415/256
492/182
492/333
表A.1（续）
定量离子对
387/228
436/277
415/199
470/182
去簇电压
(DP)/V
碰撞气能量
(CE)/V
-TKANiKAca
SN/T2050—2008
碰撞室出口电
压(CXP)/V
SN/T2050—2008
附录B
（资料性附录）
14种β内酰胺类抗生素标准品的定量离子对重构离子色谱图583. 62
12. 7914. 74 16. 91 19. 46,20. 1R 22. 62, 23. 62,24. 119.14
t/rnin
a）羟氨苦青霉素
t/unin
b）氨芋青霉素
c）头孢氨节
d）头孢匹啉
e）头孢唑啉
14种β-内酰胺类抗生素标准品的定量离子对重构离子色谱图26
等 2. Re
f）苯咪青霉素
t/rmin
g）甲氧苯青霉素
h）苄青霉素
i）苯氧甲基青霉素
i）苯唑青霉素
t/imin
k）苯氧乙基青霉素
图B.1（续）
TiKAONiTKAca-
SN/T 2050—2008
22212628
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