【国家标准(GB)】 贝类中麻痹性贝类毒素的测定

ICS67.040
中华人民共和国国家标准
GB/T5009.213--2008
贝类中麻痹性贝类毒素的测定
Determination of paralytic shellfish poison in shellfish2008-11-21发布
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中华人民共和国卫生部
中国国家标准化管理委员会
2009-03-01实施
中华人民共和国
国家标雅
贝类中麻痹性贝类毒素的测定
CB/T 5000.213—2008
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2009年3月第一版
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GB/T 5009.213—2008
本标准修改采用国际分析家协会（AOAC）官方方法AUAC958.08《麻痹性贝类毒素生物检测法》(Paralytic shellfishpoisonbialogical method)。本标推与AOAC方法相比主要差异为：增加了“规范性引用文件”“术语和定义”；—”增加了仪器和设备”；
一对“试样制备与保存”、“试剂和材料”进行了修改；在“结果判断及表述”中增加了鼠单位毒力表示方法本标准的附录 A、附录 B为规范性附录。本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。本标准由中华人民共和国卫生部负贡解释。本标准起草单位：中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局、中华人民共和国云南出入境检验检疫局。
本标推主要起草人：曹际娟、秋艳、麻丽丹、高世光、于兵、孙哲平、于杰、黄人亮、郑惠芳、李天顺、赵昕、郑秋月。
合品成伴网httn：
1范围
贝类中麻痹性贝类毒素的测定
本标准规定了贝类及其制品中麻痹性贝类垂系的测定方法。本标推适用子贝类及其制品中麻痹性贝类毒素的测定。2规范性引用文件
GB/T 5009.213-2008
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注H期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内穿）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标推达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注口期的引用文件，其最新版本适用于本标难。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB14925实验动物环境及设施
3术语和定义
下列术语和定义适用于本标准。3. 1
麻痹性贝类毒素paralytic shellfishpaisn;PsP以石房蛤毒素（saxitoxin，STX)为代表，摄食后可产生麻痹作用的存在于贝类体内的海洋尘物毒性物质的总称。
鼠单位mouseunit;MU
对体重为20g的ICR雄性小鼠腹腔注射1mL麻穿性贝类毒素提取液，使其在15min内死亡所需的最小毒素量。
4原理
本标准采用鼠单位法对PSP予以定量。以石房蛤毒素作为标准，将鼠单位换算成毒素的微克数。根据小鼠注射贝类提取液后的死:时间，查出鼠单位，并按小鼠体重，校正鼠单位（correctedmiousuunit，CMU），计算确定体100g贝肉内的PSP微克数。所测定结果代表存在了贝肉内各种化学结构的PSP毒素总最。
5试剂和材料
除非另有规定，本标准所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682规定的一级水。5.1盐酸溶液(0.18mol/1.):将15ml.浓盐酸(HCl)用蒸馏水稀释至1L。5.2盐酸溶液（5mol/L）：将41.7mL浓盐酸用蒸馏水稀释至100ml。5,3氨氧化钠溶液(0. 1 mol/1.):将 4. 0 g 氢氧化钠(Na0H)溶于 1 L 蒸馏水中。5.4石房蛤毒素（saxitoxin，Ch。HizN，U·2HCI)标准溶液（100μg/mL)：用蒸馏水配制20%（体积分数的乙醇溶液,用 5 mol/L盐酸调节 pH到 2.0~4. 0之间,用上述溶液配制石房蛤毒素。5.5小鼠：体重为19g～21g的健康ICR系雄性小鼠，可通过查表B.1得到小鼠体重校正系数。5.6蒸馏水(pH3.0)：用盐酸调pH至3.0。GB/T 5009.213—2008
6仪器和设备
6.1均质器。
6.2电炉。
6. 3天平:感量 0. 1 g,0. 000 01 g。6.4离心机。
6.5 pH 计或 pH 试纸。
6.6秒表。
6.7玻璃器Ⅲ：烧杯、量筒、容量瓶、移液管、揽拌棒等。次性注射器;1 inl.。
6.9冰箱。
7试样制备和保存
：7.1试样制备
分析样品要有充分的代表性.应从足量（-般应2kg以上)的混合样品中挑选良好的贝类去壳，用于分析的去壳肉量应达200以上。不能及时送检的新鲜贝类，按7.1.1或7.1.2方法将贝肉分离，将沥水后的200多贝肉放人0.18mol/1、200mL的盐酸溶液中，置4℃冷藏保存，备检。7. 1. 1 牡蛎、蛤及贻贝
用清水将贝尧外表彻底洗净，切断闭壳肌，开壳，用蒸馏水淋洗内部去除泥沙及其他异物。将闭壳肌利连接在胶合部的组织分开，仔细取出贝肉，切勿破贝体。严禁加热或用麻醉剂开壳。收集药200 g肉分散置于筛子中沥水5 min(不要使肉堆积),检出碎壳等杂物，将贝肉粉碎备用。7.1.2扇贝
取可食部分用作检测,过程同7.1.1，7.1.3冷冻贝类
在室温下，使冷冻的样品（带壳或脱壳的)自然融化，按7.1.1方法开壳、淋洗、取肉、粉碎、备用7.1.4贝类罐头
将罐内所有内容物（肉及液体)倒人均质器中充分均质。如果是大罐，将贝肉沥水并收集下的液体分别称重并存放固形物和汤汁，将固形物和汤汁按原罐装比例混合，均质后备用。7.1.5用酸保存的贝肉
沥去酸液，分别存放贝肉及酸液，备用。7.1.6贝肉干制品
十制品可于等体积0.18 mol/L盐酸溶液中浸泡 24h～48 h(4℃冷藏),按 7. 1.4方法沥干,分别存放贝肉和酸液备用。
7.2试样保存
送检样品应尽可能及时检验，如不能及时检测，可按200样品按7，1法处现，加人200mL0. 18 mol/I酸溶液，置1 ℃冷藏保存。8检验步骤
8.1IST标准品对照试验
8.1.1PSP 标准工作液的配制
用移液管取 1 mL.浓度为100μg/mL的石房蛤毒素标准液于100 ml.容量瓶中,删入蒸馏水(5.6）并定容，PH在2.0~4.0之间。该溶液为1g/mL石房蛤毒素标准液，该标推波可在3℃～4℃下稳定2
数周。
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用10mL、15mL20mL、25mL和30mL的蒸馏水（5.6）分别稀释1g/mL的石房蛤毒素标准液10mL，配制成系列浓度的标准稀释液。8.1.2中位数死亡时间的标准液选择取按8.1.1配制的系列浓度的标准稀释液各1mL，腹腔注射小鼠数只，选择中位数死亡时间为5tnin～7min的浓度剂量。如某浓度稀释液已达到要求，还需以1mL蒸馏水(5.6)的增减量进行补充稀释试验。例如：用25mL蒸馏水（5.6）稀释的10mL标准液在5min~-7min杀死小鼠，还需进行24ml.+10mL和26mL+10mL稀释度的试验每只小鼠试验前称重，以10只小鼠为一组，用中位数死亡时间在5min～7min范围内的两个浓度含量的标准稀释液注射小鼠，测定并记录每只小鼠腹腔注射完毕至停止呼吸的所需死时间。8.1.3毒素转换系数（conversionfaetor，cF)的计算8.1.3.1小鼠中位数死亡时间的选择计算所选择浓度的标准稀释液受试组中位数死亡时间。弃去中位数死亡时间小于5min或大了7min的受试组;选择中位数死亡时闻在5 min7 min的受试红,该受试组中可有个别小鼠的死亡时间小于5min或大于7nil。
8. 1. 3.2校正鼠单位(CMU)的计算对于所选定的中位数死亡时间为5min～7nin的受试组，根据附录A查得组中每只小鼠死亡时间所对应的鼠单位（MU），再根据附录B查得组中每只小鼠质量所对应的质量校正系数，同---只小鼠的质量校正系数与鼠单位相乘得该只受试小鼠的校正鼠单位（CMU)。8.1.3.3转换系数(CF)的计算
对丁选定的受试组，用该受试组所选稀释液每毫升实际毒素含最的微克数（以石房毒素为例计算),除以受试组中员小鼠的CMU值,得到单只小鼠的毒素转换系数(CF),计算见式(1),再计算每组10只小鼠的平均CF值，即为组内毒素转换系数。CF=CMU
武中：
CF——转换系数;
一每毫升STX实际毒素含量，单位为微克毫升（ug/mL）；CMU——校正鼠单位。
8.1.3. 4组间毒素转换系数(CF)的计算1
取不间受试组组内毒素转换系数的平均值，即为组间毒素转换系数。以组间毒素转换系数进行9.2中检测样品的毒力计算。
8.1.3.5CF值定期检查
如FSP检间隔时间较长，每次测定时要用适当的标准稀释液注射5只小鼠，重新测定CF慎。如果一周有九次检测，则用中莅数死亡时间5min～了m的标雅稀释获每周检查一次，测得的CF值应在原測定CF值的士20%范围内。若结果不符,用尚样的标准稀释液另外注射5只小鼠，综合先前注射的5 只小鼠结果,算出CF值。并用同样的标准稀腋注射第二组 10 ！小鼠，将第二纽求出的CF值和第一组的CF值班行平均，即为一个新的CF值。重复检查的CF值通常在原结果的土20%之内，茗经常发现有较大偏差，在进行常规检测前应调查该方法中是否存在未控制或未意识到的可变因素。8.2试样提取
8. 2. 1 取 100 g按 7. 1. 1,7. 1. 2、7. 1. 3 或 7. 1. 4 处理的样品于 800 m1. 烧杯中,加 0. 18 mol/1 盐酸溶液100 mL充分搅拌,均质，调整 pII 在 2. 0～4. 0范围内;按 7. 1. 5 或 7.1. 6及 7. 2 处理的样品,取3
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100g贝肉，加人相应的酸液100mL，调pH为2.0~～4.0后均质。必要时，川遂滴加入5mo1/L盐酸溶液或.1mol/L氢氧化钠溶液调整pH，加碱时速度慢，同时需不断搅拌，防止局部碱化破坏毒素。8.2.2将混合物加热，并文火煮沸5minl，冷却至室温，将混合物移至量简中并稀释至200ml.，调节pH至2.0～4.0(pH值切勿≥4.5)。8.2.3将混合物倒回烧杯，搅拌均匀，自然沉降至上清液呈半透明状，不堵塞注射针头即可，必要时将混合物或上清液以3000r/min离心5min，或用滤纸过滤。收集上清液备用。8.3小鼠试验
8.3.1取19.0名~-21.08健康ICR雄性小鼠6只，称重并记录质量。随机分为实验组和空白对照组(0. 18 tol/1. 盐酸)两组,每组三只。8.3.2对每试验小鼠腹腔注射1mL提取液或空白对照液。注射过程中若有-滴以上提取液出须将该只小鼠丢弃，并重新注射一只小鼠。8.3.3记录注射完毕时间，仔细观察并记录小鼠停止呼吸时的死亡时间（到小鼠呼出最后一-口气止）。8.3.4若注射样品原液后，一只或两只小鼠的死1：时间大于7min，则需再注射至少三只小鼠以确定样品的毒力。
8.3.5著小鼠的死亡吋间小于5min，则要稀释样品提取液后，再注射另一组小鼠（三只），直至得到5 min~-7 min 的死L亡:时间;稀释提取液时,要逐滴加人 0. 18 t1ol/L 盐酸溶液,调节 pH 至 2.0~1. 0,8.3.6注意事项：
为避免毒素的危害，应戴手套进行检验操作。移管等用过的器材应在%的饮氯酸钠浴液中友泡1h以1，以使毒素分解。同样，废弃的提取液等也应以5%次氯羧溶被处理。小鼠户体应按GB14925要求焚烧处理，其排放物应达到污物焚烧排放规定的要求，9 结果的计算与判断
9.1待测样品校正鼠单位(CMU)的确定根据待测样品的小鼠死亡时间,在附录 A中查出相应的鼠单位数 MU;根据小鼠的质量，在附录 B中查出其对应的质最校正系数。同一只小鼠的鼠革位与质量校正系数相乘，即得该只小鼠的CMU。选取检测样品受试组中三只小鼠 CMU的中位数，即为该样品受试组的中位数CMU,以此值进行9.2的计算。
9. 2毒素毒力的计算与结果表述9. 2. 1PSP 毒力的计算与结果表述9.2.1.1PSP毒力的计算
每 100 样品中PSP的含量按式(2)计算。X = CMU × CF× DF × 200
式中：
X——每100g样品中PSP的含量，单位为微克每百克(g/100g)：CML
检测样品受试组小鼠的中位数校正鼠单位CF
毒素转换系数；
DF--稀释倍数；
表示样品提取液定容的体积，单位为毫升(mL)(提示：8.2.2操作中该定容体积为200 mL）。9.2.1.2PSP 毒力的结果表述
若空白对照组小鼠正常，则报告待测样品中PSP毒素含量为：×××ug/100g。9.2.2MU 毒力的计算与结果判断9.2.2.1MU毒力的计算
对于取得麻痹性贝类毒素标准品有困难的实验室，可按式(3),使用鼠单位MU对检验结果进行计算。
式中：
Y = CMU, × DF×200
每100名样品的MU值，单位为鼠单位每百克（MU/100g）；Y
CMU.一：检测样品受战组小鼠的中位数校正鼠单位；DF-稀释倍数；
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-（3)
一表示样品提取液定容的体积，单位为毫升（mL)C提示：8.2.2操作中该定容体积为200mL）。200
注：检验结果的仲裁以9.2.1为准。9.2.2.2MU毒力的判断与结果表述在空自对照组小鼠正常的情况下进行如下判断和表述：若小鼠的死亡时间大于60rnin，则待测样品的鼠单位即当小于0.875MU/g。若实验组中位数死亡时间小于5min，则应对样品提取液进行稀释，再选取三只小鼠进行试验，直至得到中位数死亡时间为5min～7min为止，根据最后的稀释液实验结果计算样品的鼠单位毒力，报告该样品的鼠单位为：×××MU/100g。若实验组中位数死门时间大于7min，则直接计算确定样品鼠单位毒力，报告该样品的鼠单位为：XxxMU/100g.
若实验组中所有小鼠在观察15min内均不死：，则也可报告该样品的鼠单位小于400MU/100g。品纯伴网
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附录A
(规范性附录）
麻痹性贝类毒素死亡时间-鼠单位的关系麻痹性贝类毒素死t:时间-鼠单位的关系见表A.1。表A.1
麻痹性贝类毒素死亡时间鼠单位的关系肘问
1'15″
2'40″
3'10″
320″
鼠单位/MU
8'15″
10'00%
10'30*
11'30\
14'00*
http://foodmate.net鼠单校/MU
17'00\
20'00\
22'00\
鼠单位/MU
表A.1（续）
24'00\
30'00*
40'00\
60'00m
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鼠单位/ML
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小鼠体重校正系数见表 B. 1 ,
小鼠体重/g
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附录B
(规范性附录）
小鼠体重校正表
小鼠体重校正表
http://
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