【国家标准(GB)】 食品中叶酸的测定

FCS 67.040
中华人民共和国国家标准
GB/T 5009.211—2008
食品中叶酸的测定
Determination of folates in foods2008-11-21发布
中华人民共和国卫生部
中国国家标准化管理委员会
2009-03-01实施
GB/T 5009.211—2008
本标准修改采用国际分析家学会（AOACINTERNATIONAL)巾AOAC941.12《维生素预混料中叶酸的测定》Folicacid in vitaminpreparations)。本标准与A0AC944.12相比主要差异为：增加了普通食品试样提取步骤；扩人了适用范围。
本标准的附录 A 和附录 B为资料性附录。本标准由中华人民共和国卫生部提出并口。本标准由中华人民共和国卫生部负责解释。本标起草单位：中国疾病预防控制中心营养与食品安全所、辽宁省疾病防控制中心、渐江省医学科学院、北京市营养源研究所。本标准主要起草人：王竹、杨晶明、张旭、马景宏、唐靓、李跃中、工克诚。合品成伴网httn：/
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1范围
食品中叶酸的测定
本标规定了食品中叶酸的测定方法，本标准适用于食品中叶酸的测定。GB/T 5009.211—2008
本标准的检出限：普通食品，当称样量为5g时，检出限为2μg/100g；营养素补充剂、强化剂及混料，当称样量为1g时，检出限为2ug/100g。2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括劫误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标难达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用丁本标准。CB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（(GI3/T6682—2008，ISO3696：1987MOD）3原理
叶酸是细菌生长所必需的营养素，在-定控制条件下，细菌的生长响应与培养基中叶酸含量呈线性关系。用比独法测定试样液中细菌增殖后的混浊度，避过与标准曲线相比较计算出试样中叶酸的含量。4试剂
除另有说明外，所用试剂均为分析纯，实验用水为GB/T6682规定的二级水。4. 1 甲苯(C,H.).
磷酸钠(Na,PO.-12H,O)
磷酸二钠(Na,HPO4·7H,)
抗坏血酸(C,H:O,)。
无水乙醇(C2H.0)
氨氧化钠(NaOH)。
盐酸(HCI)。
4.8鸡映酶(chickenpancrcase)”。4.9木瓜蛋白酶（papain)3)。
4.10淀粉酶(taka-diastase)\)。4. 11叫酸(CsHN,O):纯度>98%。2葡糖(C,HO,)。
4.13蛋白陈（peplone)
4.14酵母提坡物(yeast extract)。1）由Difco公司提供的产品。给出这信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使川这些等效的产品。由Sigma公司提供的产品。给出这--信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他23
等效产品具有相间的效果，则可使用这些等效的产品。1
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4.15琼脂。
磷酸氢一钾(K,HPO）。
磷酸—氢钟(KH,PO,·3H,O)。
硫酸镁（MgSO·7H,0)。
氯化钠(NaCl)。
硫酸亚铁(FeSO·7H,O)。
硫酸锰(MnSO.·H,O)。
漠麝香草酚蓝(CHBrzO.S)：指示剂。磷酸缓冲液（0.05mol/L，pH6.8）：分别称取4.35g磷酸钠（4.2)和10.39g磷酸氢二钠（4.3)，4.23
用水溶解至1L。临用前按大约5g/L的比例加人抗坏血酸(4.4),使pH值为6.8，乙醇溶液（1+4）：量取200mL乙醇（4.5)与800ml.水混匀。4.242
氢氧化钠乙醇溶液（0.01mo1/L）：称取0.1g氢氧化钠（4.6)用乙醇溶液（1十4)（4.24)溶解并稀4.25
释至！000mL，
4.26氮氧化钠溶被（1mol/L)：称取4g氢氧化钠（4.6),加水溶解并稀释至100ml。4.27
盐酸溶液（1mol/L）：吸取8.4ml.盐酸（4.7),用水稀释至100mL，4. 28
鸡胰酶液：称取100mg鸡胰酶（4.8），加人20mL磷酸缓冲液（4.23)，研磨至匀浆。现用现配。4.29蛋白酶-淀粉酶液：分别称取200mg木瓜蛋白酶（4.9）和淀粉酶（4.10），加人20ml.磷酸级冲液(4.23)研磨至匀浆。现用现配。4.30叶酸标准储备液（20.0μg/mL）：精确称取20,0mg叶酸（4.11)置于1L容量瓶中，用氢氧化钠Z醇溶液（4.25)溶解并定容笔刻度。储存于棕色瓶中，2℃～4℃冰箱保存网年。当叶酸（4.11）纯度不够或储存时间超过半年以上时，需按附录A进行浓度标定再使用。4.31叶酸标准中间液（20,0ng/mL）：准确吸取100mL叶酸标推储备液（4.30)置于1L容量瓶中，用氢氧化钠乙醇溶液（4.25)稀释并定容至刻度，混勾后储存于棕色瓶中2℃～4℃冰箱保存…-年。4.32叶酸标准工作液（0.200ng/mL）：临用前吸取1.00mL叶酸标准中间液（4.31），置于100mL容量瓶中，用水稀释定容至刻度。临用前现配。4.33甲盐溶液：分别称取25磷酸氢二钾（4.16）和25g磷酸二氢钾（4.17)，加水溶解并稀释至500mI.。加人3滴～5滴中苯，2℃～4℃冰箱可保存一年。4.34乙盐溶液：分别称取10g硫酸镁（4.18)、0.5g氯化钠（4.19)、0.5g硫酸亚铁（4.20)和0.5g硫酸锰（4.21)，加水溶解并稀释至500mL。加5滴盐酸（4.7)，2C~4℃冰箱保存一年。4.35漠麝香草酸蔬溶液：称取0.1g溴香草酚蓝(4.22)于研体中，加1.6mL0.1mol/L氢氧化钠溶液研磨，加少许水继续研磨垒完全溶解，用水稀释至250rL。此指示剂变色终点为草绿色（pH6.8）。4.36基础培养液：可按附录B配制叶酸测定用基础培养液，也可直接出试剂公司购买叶酸测定培养基于粉（falicacidcaseinmedium)），用前根据需要量按说明书配制。效力相当。4.37菌种储备用琼脂培养基：按表1各成分用最称取或吸取混合后，加水至100mI.，沸水浴加热至琼脂完全溶化：趁热以溴摩香草酚蓝为外指示剂，用1mol/L盐酸溶液（4.27）调节PH至指示剂呈草缘色，如过最用」mol/L氢氧化钠溶藏（1.26）回调pH至6.8.尽快分装于试管中，每管3mL～5mL，视试管内径粗细而定，液通高度不得低于2cn1。塞上棉塞，121℃高压火菌10min：取出后直立放置，待冷却后于冰箱内保存，
3）由I>ifn公司提供的产品商品名。给出这一信总是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效的产品。2
h
葡葡糖
蛋白陈
酵母提取物干粉
三水合乙酸钠
甲盐溶液
乙盐液
仪器和设备
天平：感量0.1mg。
表1菌种储备用琼脂培养基配制一览表剂
电热恒温培养箱：37℃土1℃。
压力蒸汽消毒器。
蔬涡混器。
5.5离心机。
5. 6 接种针和接种坏。
5.7pH计精度±0.01。
分光光度计。
超净台。
6菌种的制备与保存
6.1菌种:于酪乳杆菌 Lactoharillus casei(ATCC 7469)。用
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0, 2 g
6.2储备菌种的制备：将于酪乳杆菌菌种转接至菌种储备用琼脂培养基（4.37)中，在37℃士1℃恒温培养箱中培养16h～24h。取出后放人2℃~4℃冰箱中保存，至少每隔7d传种一次，保存数周以上的储备菌种，不能立即用作接种液制备，需在使用前每天接种一次，连续传代2次～3次后方可使用，以增加细菌活力，提高细菌的灵敏度。6.3接种液的制备：试验前一天，取1ml.叶酸标准工作液和10mL基础培养液混勾，分装至四支5mL离心管中，塞上棉塞，于121℃高压灭菌15min后即为种于培养液：冷却后用接神环将培养了16h～24h的·「酪乳杆菌储备菌种转种至两支子培养液中，于37℃土1℃恒温培养箱中培养16h~201。取山后将种子培养液混悬，无菌操作下吸取0.2mL转种至另两支已消薛的种子培养液中，丁37 ℃±1℃再培养 6 h。振荡混匀,制成菌种混悬液,立即使用。7测定步骤
所有操作均需避光进行。
7.1试样提取
7.1.1普通食品：准确称取适景试样（约含0.2μg～2μg叶酸），精确至0.001g。一般谷薯类、肉类、鱼类、乳类、果蔬、藻类2g～5g;蛋类、豆类、坚果类、饲料等1g~3g；内脏0.2g~1g：半流质或流质5g~10g。转人100mL锥形瓶中，加30mL酸缓冲液（4.23），振摇后于121℃高压水解15min，取出冷却至室温。加入1mL鸡胰酶液（4.28），如试样中含有蛋白质、淀粉需另加入1mL蛋白酶-淀粉酶液（4.29），加人3滴～5滴甲苯，充分混合，置下37℃土1℃恒温培养箱内酶解16h~20h，取出，转3
http
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入100mL容量瓶，加水定容至刻度，过滤。另取一支25ml.刻度试臂，加人15mL磷酸缓冲液，1mL鸡胰酶液和（或)1tL蛋白酶淀粉酶液，混合，同试样.-起温育后，加水定容至25.0m1后过滤，此为空液。
7.1.2营养素补充剂、强化剂及预混料：准确称取0.1g~0.5g试样，精确至0.001g，转人100mL容量瓶中，加人80mL氢氧化钠乙醇溶液（4.25)振摇提取过夜（4以上），用水定容至刻度。7.2稀释
如有必要，用水对样提取液进行适当稀释，使稀释后试样提取液中叶酸含量在0.2ng/mL~~0.4ng/mL范围内。
7.3测定管制备
7.3.1试样笃和酶空白管.取二支试管，分别加入试样提取液或酶空白液0.5mL.、1.0mL、2.0mL，补水至5.0mL，加入5.0ml基础培养液（1.36），混勺，7.3.2标推系列管：取试管分别加入叶酸标准工作液0.00mL、0.25mL、0.50tmL、1.00mL、1.50nL.2.00mL.2.50ml..3.00mL,4.00mL和5.00ml.,加水至5.00mL，相当于标准系列管中叶酸含量为0.00ng、0.05ng、0.1.0ng、0.20ng.0,30ng、U.10ng、0.50ng.0.60ng、0.80ng、1.00ng加5.0mL基础培养液（4.36），混匀。为保证标准曲线的线性关系，至少应制备两套标准系列管，绘制标准曲线时，以每点的均值计算。7.4培养
7.4.1灭菌：将所有測笼管塞好棉塞，于121℃高压火菌15min。7.4.2接种和培养：快速冷却试臂至室温，在无菌操作条件下，每管接种一滴菌种混悬液。置于37℃上1℃恒温培养箱中培养20h～40h，直至获得最大混浊度，即再培养2h，透光率变化不超过2%。另准备一支标准管（含0.0ng叶酸)不接种作为对照。7.5测定
将培养好的试样管、酶空白管、标准系列管用旋涡混匀器混匀。用厚度为1cm比色杯，于540nm处，以末接种的标推管调节透光率为100%，然后依次测定标准系列管、试样管和酶空白管的逻光率。如果接种后标准系列管中的0管透光率在90%以下，或与木接种的标推管相比标准系列管透光率最大变化量在40%以下时，说明有杂菌或不明来源的叶酸混入，需重做实验。7.6结果计算
以标准系列管叶酸含显为横坐标、透光率为纵坐标，绘制标准曲线。从标准曲线查得试样管或酶空白管中叶酸的相应含量，如果每个试样的三支试样管中有两支叶酸含量落在0.20ng1.0n范围内则可继续按式（1)、式（2)进行结果计算，否则需重新取样测定。酶空白液中叶酸含量按式(1)计算：mzX25
式中：
ml“-鸡胰酶液或(和)蛋白酶-淀粉酶液中叶酸含量，单位为纳克(ng)；m2—-从标准曲线上查得空向管中叶酸含量，单位为纳克（ng）；25——酶密白液总体积，单位为亳升(mL）；V。一制备酶空白管时吸取的酶空白液体积，单位为掌升(mI)。试样中计酸含量按式(2)计算：
式中：
×V,×f-m
X-试样中叫酸含量，单位为微克每百克（ug/100g）；4
...-(2)
从标曲线上查得试样管中叶酸含量，单位为纳克(ng)：制备试样管时骏的试样液体积，单位为毫升(mL)；试样提取液定容体积,单位为毫升(mL)；试样液稀释倍数；
鸡胰酶被或(和)蛋白酶-淀粉酶液中叶酸含量，单位为纳克(ng)：试样质量，单位为克（g)；
由纳克每克(ng/)换算为微克每百克(μg/100g)的系数。GB/T 5009.211—2008
注：首养素补充剂、强化剂及预混料等试样提取步骤中因无酶解处理，放无需计算酶空白液中叶酸含量，即式(2)中m -- 0.
8精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。合品成伴网httn：/
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A.1测定
附录A
（资料性附录）
叶酸标准储备液浓度的测定
准确吸圾1.0mL标准储备液至10ml.容量瓶中，用氢氧化钠溶液(0.1mol/L)定穿至刻度。以氢氧化钠溶液（0.1mol/L)调零点，比色杯厚度1cm，波长256nm，用紫外分光光度订测定二次吸光度值,取平均值。
A,2计算
按式(A,1)计算标准储备液叶酸浓度。A
×M×10×10%
式中：
标准储备液中叶酸度，单位为微克每毫升（ug/mL.)A
-平均吸光度值；
摩尔消光系数，24500；
M—叶酸相对分子质量，441.42；10—
-稀释倍数；
一由克每升换算为微克每毫升的换算系数。品成伴网httn：/
-...( A, l)
B.1试剂
无水乙醇(C H,0)。
附录B
（资料性附录）
叶酸测定用基础培养液的配制方法不含维生素的酪蛋白(vitamin free casein）。碳酸氨钠（NaHCO,）。
碳酸氢钠(NaHCO,)溶液：U.1mol/L。盐酸(HCI)。
盐酸溶液：3mal/L,1mol/L。
氢氧化钠(NaOH)溶液：10mol/L.1mol/L。胰酶（pancreatin)
礁藻土。
冰乙酸(C,H,0,)
乙酸溶液：0.02mol/L。
活性炭。
硫酸腺嘌呤(CI.HNi。·HSO.)。盐酸鸟嘌呤(CH.N.O，·HC1)
尿嘧啶(C,H,N,O,)。
黄嘌呤（CHN.O）
氨水(NH,0)。
三水合乙酸钠(C.H.O,Na·3H,O)。核黄素(CI, H2 NO)。
生物素(C1:H1sN,O,S)。
对氨基苯甲酸(C,H,NO）。
盐酸吡哆醇(CH,NO·HCI)。
盐酸硫胺素(CHCIN,OS·HCI)
泛酸钙(C: H2CaN,Oi)
尼克酸(C,H,NO,)
聚山梨酯-80（吐温-80）。
还原型谷胱甘肽(ClHN,O.S)
L-天冬氨酸(C,H,NO)。
L-色氨酸(CHN,O,)。
L-盐酸半胱氨酸(C,H,NO,S·HCI)无水葡萄糖(C,H1O.）。
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漠麝香草酚蓝(CHzgI3r2O.S)溶液：按4.35配制。澳酚蓝(C.H1Br,O,S)溶液：0.1g/100mL，无水乙醇(I3.1.1)配制。此指示剂变色终点为草绿色（pH 3.5）
酪蛋白液：可按下列任--种方法制备。7
bttp:
rungfooc
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B.1.35.1酶解酪蛋白液：称取60g不含维生索的酪蛋白(13.1.2)至1L烧杯中，慢慢加入1L碳酸氢钠溶液（13.1.4),以防止结块，用10mol/L氢氧化钠液（13.1.7)调节pH值至8.0.加人300mg腰酶（B.1.8），搅拌20min,使胰酶充分混匀。加入2.5InL甲苯(B.1.9）,置37℃土1℃溢培养箱中酶解48h～72h，从恒温培养箱中取出酪蛋向酶解液，于121℃高压30min以终止反应，冷却至室温。加人10g硅藻上（B.1.10),缆拌均句，用布氏漏斗过滤，滤液用约60mL冰乙酸（B.1.11)调节pHI值至3.7。称取12g活性炭（B.1.13），加入滤液中准确搅拌10min，用铺有10g硅藻土的布氏漏斗过滤，滤液从“称取12g活性炭..\开始重复操作两次。最终滤液用水稀释至1200mL。取10ml酶解酪蛋白液于平Ⅲ中150℃烘下至恒重，如固体含量40mg/mL，则弃除酪蛋白液，重新制备。制备好的酪蛋白液加1mL～3ml.甲苯(B.1.9),2℃~～~4℃冰箱冷藏保存一年B.1.35.2酸解酪蛋白液：称取50g不含维生素的酪蛋白（B.1.2）丁50DmL烧杯中，加200mL盐酸溶液（13.1.6），于121℃高压水解6h。将水解物转移至蒸发血内，在沸水浴上蒸发至旁状。加200ml水使之溶解后再蒸发至膏状，如此反复三次，以除去盐酸。以漠酚监（B.1.34)作外指示剂，用10mo1/L氢氧化钠(B.1.7)调节pH值至指示剂额色转为草绿色（pH3.5)。加20g活性炭（B.1.13),振播约20min，过滤。重复活性炭处理直至滤液呈谈黄色或无色。滤液加水稀释至1000ml，加1mL～3ml甲苯,置 2 ℃~4 ℃冰箱中保存一年。距：每次燕发时不可蒸干战焦糊，以避免所含营养素破坏。B.1.36腺嘌呤-鸟嘌呤-尿嘧啶溶液。分别称取硫酸腺嘌呤(B.1.14)、盐酸鸟嘌呤(B.1.15)以及尿嘧啶（B.1.16)各0.1g于250mL烧杯中，加75mL水和2rnL盐酸（B.1.5)，加热使其完全溶解后冷却。若有沉淀产生，再加盐酸数滴，加热，如此反复自至冷却后无沉淀产生为止，加水至100tuL。加3滴～5滴甲举，贮存于棕色试剂瓶中，置2℃～4℃于冰箱中可保存一年。B.1.37黄嘌岭(C,II.N.O2)溶液：称取0.4g黄嘌呤(B.1.17),加10mL氨水(3.1.18).加热溶解，加水至100ml-。加3满~5滴甲苯，贮存于棕色试剂瓶中，2℃～4℃冰箱保存一年。B.1.38乙酸缓冲液（1.6mol/L，pH4.5）称取63g三水合乙酸钠（B.1.19），用200mL水溶解，加人约20ml.冰乙酸（B.1.11），调节pH至4.5，混合后，用水稀释至500ml，B.1.39维生素液：称取100mg核黄素(B.1.20)用400mL乙酸缓冲液(B.1.38)溶解，取25mg碳酸氢钠（B.1.3)溶解于500mL水中，加入2mg生物素（B.1.21)、200mg对氨基苯甲酸（B,1.22)400mg盐酸吡哆醇（B.1.23）、40mg盐酸硫胺素（B.1.24）、80tng泛酸钙（B.1.25）、80mg尼克酸（B.1.26）溶解。将上述溶液混合，加水全1000mL。加入3滴～5滴甲苯，贮存于棕色试剂瓶中，2℃~4℃冰箱保存一年。
B.1.40聚山梨酯-80(吐温-80)溶液：将10名聚山梨酯-80(B1,27)溶于无水乙醇（H.1.1)中并稀释至100mL,2℃~～4℃冰箱保存。
B.1.41还原型谷胱甘肽(CHN.O.S)溶液：称取0.1g还原型谷胱甘肽(B.1.28）,加100mL水溶解，贮于棕色瓶中，2℃~℃冰箱保存。B.1.42盐溶液：按4.33配制。
B.1.43乙盐溶液：按4.34配制。B.2基础培养液
配制250nL基础培养液，按表B.1吸取藏体试剂，混含后加水150mL，依次加人固体试剂，煮沸搅拌2min。以漠糜香草酚蓝为外指示剂、用1mal/L氧氧化钠溶液调节基础培养液pH值，直至指示剂变为草绿色(pH6.8)；如果指示剂变蓝说明加入的氢氧化钠溶液过量，以1imol/L盐酸溶液回调pH值至6.8，加入乙盐溶液5mL，用磷酸缓冲液（4.23)补至250mL。2℃~4℃冰箱内可保存7d。配制时可根据基础培养液用量按比例增减。8

骼蛋白液
表B.1叶酸测定用基础培养液配制一览表用
腺嘌吟·鸟嘌吟-尿嘛啶溶液
黄嘌岭济波
维生素液I下载标准就来标准下载网
聚山梨酯·80 溶液
甲盐溶液
还原型谷胱甘肽溶液
0. 25 nl.
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固体试剂
L天冬氨醚
L盐酸半胱氨酸
L-色氮酸
无水葡萄糖
三水合乙酸钠
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